Bảng 3.1: Danh mục các cặp mồi, probe đƣợc thiết kế
STT Tên mồi Trình tự Độ dài (Bps)
1. O.tsu108S-F4 TAGTTTAGAATGGTTACCAC 20 2. O.tsu108S-R4 CTAGAAGTTATAGCGTACACC 21 3. O.tsu108S-F5 CCTCAGCCTACTATAATGCCTA 22 4. O.tsu108S-R3 CGCTGCAATTTAACAAGATC 20 5. O.tsu108S-F3 CAGCAAGCWCAAGCTACAG 19 6. O.tsu108S-Pro CAAGAAGCAGYAGCAGCWGCAGC 23 7. Rick.S-CS-F2 AAAGCAAGTATHGGTGAGGATG 22 8. Rick.S-CS-R1 ATACCGTCGCAAATGTTYAC 20 9. Rick.S-CS-F6 GCAGAATGCTTCTACTTCAAC 21 10. Rick.S-CS-F1 ATACCGTCGCAAATGTTYAC 20 11. Rick.S-CS-Pro1 TGTGCCATCCAGCCTAYGGTTCTTGC 26
Trong quá trình thiết kế mồi, chúng tơi nhận thấy tại một số vị trí của vùng gen đặc hiệu có nhiều hơn một loại nucleotide khi so sánh giữa các lồi (hình 3.1, hình 3.2). Bởi vậy, mồi và probe của chúng tôi sẽ thay thế bởi các nucleotide tương ứng tại vị trí đa hình đó theo danh pháp IUPAC như trong bảng 3.1.
3.1.2. Thiết kế plasmid chuẩn dương cho phản ứng real-time PCR
Để tạo chuẩn dương plasmid cho O. tsutsugamushi và Rickettsia, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 10 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nghi ngờ sốt do Rickettsiaceae điều trị tại Viện lâm sàng các bệnh truyền nhiễm, Bệnh viện Trung ương quân đội 108. ADN được tách từ bệnh phẩm máu và mô xung quanh vết loét được sử dụng để làm khuôn cho các phản ứng nested PCR phát hiện O. tsutsugamushi và
Rickettsia cụ thể như sau: các cặp mồi O.tsu108S-F4 (Ori F4) và O.tsu108S-R4
(Ori R4), cặp O.tsu108S-F5 (Ori F5) và O.tsu108S-R3 (Ori R3) lần lượt là các PCR vịng ngồi (PCR-O1) và PCR vòng trong (PCR-O2) khuếch đại đặc hiệu gen
56kDa của O. tsutsugamushi với kích thước tương ứng là 1630bps, 725bps. Trong khi đó để khuếch đại gen gltA của các Rickettsia chúng tôi sử dụng semi-nested
PCR với Rick.S-CS-R1 (Rick R1) là mồi ngược chung cho vịng ngồi (PCR-R1) và vòng trong (PCR-R2), Rick.S-CS-F2 (Rick F2) và Rick.S-CS-F6 (Rick F6) lần lượt là mồi xi cho PCR-R1 và PCR-R2, với kích thước tương ứng là 1147bps và 520bps (hình 3.3). Vị trí bắt cặp của các primer và probe của phản ứng real-time PCR được thể hiện như trên hình 3.3 và được thiết kế dựa trên đoạn gen đích của sản phẩm PCR vòng 2 cũng là đoạn gen được sử dụng để tạo plasmid chứng dương. Với O.tsu108S-F3 (Ori F3); O.tsu108S-R3 (Ori R3); O.tsu108S-Pro (Ori Pro) là cặp
mồi và probe của real-time PCR phát hiện O. tsutsugamushi với chiều dài đoạn gen
khuếch đại là 109bps. Đối với Rickettsia cặp mồi và probe là Rick.S-CS-F1 (Rick F1); Rick.S-CS-R1 (RickR1); Rick.S-CS-Pro1 (Rick Pro1) và kích thước đoạn gen khuếch đại là 83bps.