- Tỷ lệ phân lập được các vi khuẩn gây bệnh qua nuôi cấy dịch tỵ hầu
2.4.3. Xét nghiệm phân lập vi khuẩn:
Nghiên cứu về vi sinh được tiến hành tại Khoa vi sinh Bệnh viện Nhi Thanh Hóa.
2.4.3.1. Phương pháp xác định vi khuẩn gây bệnh
Bệnh phẩm: Được lấy từ dịch tỵ hầu.
Thời điểm lấy bệnh phẩm: ngay sau khi bệnh nhân nhập Khoa Hô Hấp Bệnh viện Nhi Thanh Hóa (trước 24 giờ).
Bệnh phẩm được lấy bởi các Kỹ thuật viên khoa vi sinh hoặc do bác sĩ nghiên cứu viên thực hiện.
Dụng cụ: Dùng Sonde hút vô khuẩn số 8, bơm tiêm 20 ml, ống nghiệm đường kính 10 mm có nút bông, được hấp sấy vô khuẩn. Găng tay vô khuẩn, máy hút dịch.
Kỹ thuật: nhỏ nước muối sinh lý vào mũi bệnh nhân và dùng máy hút để hút sạch dịch nhầy ở mũi họng bệnh nhi, sau đó vỗ rung lồng ngực trong 5 phút. Đưa sonde lấy bệnh phẩm qua mũi bệnh nhi với độ dài của sonde từ cánh mũi đến dái tai, đưa sâu thêm 1-2 cm để vào đến hầu họng. Dùng bơm tiêm hút dịch ra từ từ, dây hút có bệnh phẩm được cắt vào cho vào ống nghiệm.
Bệnh phẩm sau khi lấy xong được tiến hành nuôi cấy, định danh vi khuẩn, xác định độ nhạy của vi khuẩn với các loại kháng sinh thường được sử dụng trong Bệnh viện theo quy trình chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới [68].
* Tiêu chuẩn bệnh phẩm viêm do vi khuẩn [9]: - Có mặt bạch cầu đa nhân
- Không có tế bào biểu mô - Có vi khuẩn gây bệnh.
* Các môi trường nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn và kháng sinh đồ [68].
- Môi trường thạch máu (Blood apgar base -BBL): Thạch máu cơ sở của hãng Oxoid (Anh): 500ml máu thỏ hoặc máu cừu tươi chống đông (lấy vô khuẩn): 25 ml. Thạch máu cơ sở được hấp ướt 1210C trong 30 phút. Sau đó để nguội bình thạch xuống khoảng 500C thì cho máu vào lắc đều, quay tròn bình cho máu hòa tan đều trong thạch. Màu thạch đỏ tươi là tốt, nếu màu đen là máu đã quá chín. Đổ thạch ra đĩa petri đường kính 9cm, mỗi đĩa khoảng 20 ml.
- Môi trường chocolate: Thạch máu cơ sở 500ml, máu thỏ hoặc máu cừu tươi chống đông (5-10%). Thạch máu cơ sở được hấp ướt 1210C trong 30 phút. Sau đó để nguội bình thạch xuống khoảng 800C thì cho máu vào lắc đều.
Đun cách thủy bình thạch 800C trong 10 phút. Chú ý lắc đều bình thạch. Đổ thạch ra đĩa petri đường kính 9 cm, mỗi đĩa khoảng 20 ml.
* Tiến hành nuôi cấy, phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy đếm:
Bệnh phẩm được trộn lắc đều trong canh thang (vortex) dùng ăng định lượng để lấy bệnh phẩm, cấy lần lượt trên môi trường thạch máu và môi trường chocolate ở các nồng độ 10-2, 10-3 , 10-4, 10-5, 10-6, 10-7. Sau khi cấy lật ngược đĩa thạch để vào tủ ấm 370C có khí trường 5% CO2. Sau 18-24h đọc kết quả [35]. Nếu sau 24h chưa thấy mọc thì tiếp tục để thêm trong điều kiện như trên. Sau 48 giờ nuôi cấy nếu chưa thấy vi khuẩn mọc thì bệnh phẩm đó được kết luận là âm tính. Nếu vi khuẩn mọc thì dựa vào từng loại vi khuẩn để chẩn đoán xác định theo thường quy hoặc đưa vào máy định danh vi khuẩn.
Nếu vi khuẩn mọc n khuẩn lạc tại nồng độ 10-2 thì số lượng vi khuẩn trong 1ml tính là: n.102..102 = n.10-4 (Vì nồng độ pha loãng là 10-2 và lượng dịch lấy ra để cấy là 10-2 ml). Cũng tính cách tương tự ta sẽ có số đếm vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng và cuối cùng là 10-7 sẽ là n.10-7.10-2.
* Tiêu chuẩn chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh [9], [35]: - Vi khuẩn được phân lập từ bệnh phẩm viêm do vi khuẩn. - Có số lượng trội hơn hẳn so với vi khuẩn khác.
- Số lượng vi khuẩn > 3 khuẩn lạc trong một đĩa nuôi cấy nguyên thủy. - Vi khuẩn nuôi cấy tương ứng với vi khuẩn quan sát được từ nhuộm soi trực tiếp ban đầu.
2.4.3.2. Xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh.
- Phương pháp: xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh bằng phương pháp kháng sinh khuếch tán Kirby- Bauer.
- Nguyên lý: Các chủng VK sẽ nhạy cảm với các loại KS ở mức độ khác nhau và chúng thể hiện sự khác nhau đó bằng đường kính vùng ức chế ở xung quanh khoanh giấy KS khi có sự tiếp xúc giữa khoanh giấy và KS [58].
phút cho thăng bằng nhiệt độ trong và ngoài ống. Lựa chọn KS theo từng loại vi khuẩn. Đặt khoanh giấy KS đã lựa chọn sao cho mặt khoanh giấy áp sát mặt môi trường, mép khoanh giấy cách thành trong của đĩa khoảng 15 mm và khoanh nọ cách khoanh kia khoảng 20 mm. Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút cho KS khuếch tán, để đĩa môi trường trong tủ ấm 370C từ 18 giờ đến 24 giờ. Các đĩa thử nghiệm với các chủng H.influenzae phải để trong tủ ấm có 5-10% CO2.
- Đọc kết quả: đo đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh, đường kính này được tính ra milimet tròn với thước compa trượt, hay với mẫu thước dành riêng cho mục đích này, bằng cách áp thước lên mặt sau của đáy hộp thạch.
- Đánh giá kết quả: đối chiếu kết quả thu được với bảng giới hạn đường kính vùng ức chế cho từng loại KS để phân loại thành các mức độ nhạy cảm(S) - trung gian(I) - đề kháng(R), dựa vào bảng chuẩn theo hướng dẫn của CLSI [58].
- Kiểm tra chất lượng: Mỗi lần thử nghiệm độ nhạy cảm với KS của các chủng VK đều được tiến hành song song với các chủng vi khuẩn Quốc tế.