NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.7.Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng Parafin, nhuộm Haematoxylin Ờ Eosin (HE)
Parafin, nhuộm Haematoxylin Ờ Eosin (HE)
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ựổi ựại thể cần tiến hành làm tiêu bản ựể xác ựịnh bệnh tắch vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin Ờ Eosin (HE). Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Chuẩn bị
Dụng cụ và hóa chất: Lọ chứa focmon 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc ựựng hóa chất, phiến kắnh, máy ựúc Block, khuôn ựúc Block, tủ ấm 370C, tủ ấm 560C, máy cắt mảnh microtome, nước ấm 480C, xylem, paraffin, thuốc nhuộm Heamatoxilin, EosinẦ
Lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm là gan, lách, dạ dày, ruột, tim, thậnẦ
Cố ựịnh bệnh phẩm:(mục ựắch là ựể giết chết những thành phần của tổ chức)
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%, ựể sau 7 -10 ngày là có thể sử dụng ựược.
Vùi bệnh phẩm:(tạo ra chất nền cho tổ chức ựể cắt) Tiến hành lần lượt các bước sau:
- Khử focmon: Lấy tổ chức ra khỏi bình focmon 10%, cắt thành các miếng có chiều dài 4 Ờ 5mm rồi cho vào khuôn ựúc bằng nhựạ đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h ựể rửa sạch focmon.
- đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng trong 18 tiếng. Lấy mẫu ra và tiến hành ựúc block.
Bình Hóa chất Thời gian (giờ) 1 Cồn 600C 1:00 2 Cồn 600C 1:00 3 Cồn 700C 1:30 4 Cồn 800C 1:30 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00 đúc block
Mục ựắch: để vùi miếng tổ chức trong môi trường parafin thuần nhất tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: máy ựúc block, máy làm nguội block, khuôn Block (khuôn giấy), parafin, kéo, pank kẹp, giấy, bút...
Tiến hành: đặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chắnh giữa khuôn block, ựổ nhanh parafin lỏng vào block. đặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. để nguội từ từ ựến khi ựông cứng, ựặc chắc là ựược.
Cắt dán mảnh và cố ựịnh tiêu bản
Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm 480C, phiến kắnh, pank kẹp...
Cắt mảnh: Cắt bằng máy microtom với ựộ mảnh cắt khoảng 3 - 4ộm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
Tãi mảnh: Sau khi cắt ựược, dùng pank kẹp mảnh cắt ựặt vào nước lạnh, sau ựó dùng phiến kắnh trong, sáng, không xước, sạch sẽ ựể hớt mảnh cắt cho sang nước ấm
480C rồi lấy kắnh vớt mảnh cắt sao cho vị trắ mảnh cắt ở 1/3 phiến kắnh. Sau ựó ựể tủ ấm 370C ựến khi bệnh phẩm khô là có thể ựem nhuộm ựược.
Nhuộm tiêu bản
Các bước tiến hành
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 3 - 5 phút
Xylen II: 3 - 5 phút Xylen III: 3 - 5 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn ethylic gồm 3 lọ: Cồn I (cồn 900): 5 phút
Cồn II (cồn 1000): 5 phút Cồn III (cồn 1000): 5 phút
+ Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân): Sau khi ựã rửa tiêu bản qua nước chảy trong 10 phút, lau khô nước xung quanh tiêu bản, nhỏ haematoxilin ngập stiêu bản trong 5 phút. Sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi rồi rửa nước chảy trong 10 phút cho hết Haematoxilin thừạ đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vảy khô. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản có màu xanh tắm là ựược.
Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây)
Nếu ựậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (Cồn 960 + HCl tỷ lệ HCl là 1%) trong 30 giây
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút, sau ựó rửa nước chảy trong 10 phút cho hết Eosin thừạ Lau sạch nước xung quanh bệnh phẩm.
+ Tẩy nước: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn: cồn 900I, cồn 1000I, cồn 1000II, mỗi lọ 15 giâỵ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Lấy tiêu bản ra khỏi cồn 1000II, lau sạch cồn ở xung quanh bệnh phẩm, rồi cho tiêu bản ựi qua xylen.
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể ựẩy hết bọt khắ ra ngoàị
đánh giá kết quả
Kiểm tra tiêu bản trên kắnh hiển vi quang học vật kắnh 10x40. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.