2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
2.2.3. Các bước tiến hành nghiên cứ u
2.2.3.1. Lựa chọn người hiến máu để xác định các kháng nguyên nhóm máu hệ hồng cầu:
Người hiến máu được chọn để lấy mẫu máu nghiên cứu phải đạt được các tiêu chuẩn sau:
- Có đủ tiêu chuẩn để hiến máu theo quy định của “Quy chế truyền máu”; - Không bị nhiễm các bệnh nhiễm trùng truyền qua đường máu: HIV, HBV, HCV, giang mai, sốt rét;
- Những người hiến máu này được tư vấn, giải thích về ý nghĩa nhân đạo và cần thiết của việc nghiên cứu;
- Là những người tình nguyện, đồng ý sẽ hiến máu nhiều lần trong tương lai.
2.2.3.2. Lấy mẫu máu để tiến hành nghiên cứu:
Lấy 2 ml máu tĩnh mạch vào một ống nghiệm sạch, chuyên dụng có chứa sẵn chất chống đông bằng EDTA. Lắc đều để máu không bị đông dây.
2.2.3.3. Xác định kháng nguyên nhóm máu hệ hồng cầu bằng các kỹ thuật:
a/ Kỹ thuật ngưng kết trong ống nghiệm để xác định kháng nguyên của hệ
nhóm máu Rh (D, C, c, E, e):
- Bước 1: Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh của hệ Rh (Hoặc anti D, anti C, Anti c, Anti E, anti e) vào một ống nghiệm đã được dán nhãn;
- Bước 2: Thêm 1 giọt hồng cầu 5% cần định nhóm vào ống nghiệm trên; - Bước 3: Trộn đều ống nghiệm;
- Bước 4: Ly tâm 1000 vòng/phút trong vòng 15-30 giây; - Bước 5: Nhận định kết quả
+ Phản ứng ngưng kết: có kháng nguyên D, C, c, E, e trên bề mặt hồng cầu.
+ Phản ứng không ngưng kết: Không có kháng nguyên D, C, c, E, e trên bề mặt hồng cầu;
- Bước 6: Nếu kết quả dương tính, nhỏ thêm 1 giọt Rh control, trộn đều và đọc kết quả.
b/ Kỹ thuật ngưng kết trong ống nghiệm để xác định kháng nguyên Mia:
- Bước 1: Nhỏ 2 giọt Anti Mia vào một ống nghiệm đã được dán nhãn;
- Bước 2: Thêm 1 giọt hồng cầu 5% cần định nhóm vào ống nghiệm trên (Hồng cầu cần định nhóm đã được rửa 3 lần bằng nước muối 0,9 % và pha thành 5%);
- Bước 3: Trộn đều ống nghiệm; - Bước 4: Ủ 5 phút ở 22˚C;
- Bước 5: Ly tâm 1000 vòng/ phút trong vòng 15-30 giây; - Bước 6: Nhận định kết quả
+ Phản ứng ngưng kết: Có kháng nguyên Mia trên bề mặt hồng cầu. + Phản ứng không ngưng kết: Không có kháng nguyên Mia trên bề mặt hồng cầu.
c/ Kỹ thuật ngưng kết trong ống nghiệm để xác định kháng nguyên Lea:
- Bước 1: Nhỏ 2 giọt Anti Lea vào một ống nghiệm đã được dán nhãn; - Bước 2: Thêm 1 giọt hồng cầu 5% cần định nhóm vào ống nghiệm trên; - Bước 3: Trộn đều ống nghiệm;
- Bước 4: Ủ 15 phút ở 22˚C;
- Bước 5: Ly tâm 1000 vòng/ phút trong vòng 15-30 giây; - Bước 6: Nhận định kết quả
+ Phản ứng không ngưng kết: Không có kháng nguyên Lea trên bề mặt hồng cầu.
d/Kỹ thuật ngưng kết trong ống nghiệm để xác định kháng nguyên Jka, Jkb, s,
Lua, Lub, Fya, Kpa, Kpb:
- Bước 1: Nhỏ 2 giọt thuộc thử anti Jka (hoặc anti Jkb, anti s, anti Lua, anti Lub, anti Kpa, anti Kpb) vào một ống nghiệm đã dán nhãn;
- Bước 2: Thêm 1 giọt hồng cầu 5% cần định nhóm (Pha hồng cầu 5% trong đệm Liss);
- Bước 3: Trộn đều ống nghiệm;
- Bước 4: Ủ ống nghiệm trên ở 37˚C/15phút; - Bước 5: Rửa 3 lần bằng nước muối 0,9 %; - Bước 6: Nhỏ 2 giọt kháng globulin (Loại IgG);
- Bước 7: Ly tâm 1000 vòng/ phút trong vòng 15-30 giây; - Bước 8: Nhận định kết quả
+ Phản ứng ngưng kết: Có kháng nguyên Jka (hoặc Jkb, s, Lua, Lub Kpa, Kpb trên bề mặt hồng cầu).
+ Phản ứng không ngưng kết: Không có kháng nguyên Jka hoặc Jkb, s, Lua, Lub Kpa, Kpb trên bề mặt hồng cầu).
- Bước 9: Nếu kết quả âm tính, nhỏ thêm 01 giọt hồng cầu chứng (Hồng cầu O đã được cảm nhiễm anti D), ly tâm 1000 vòng/ phút trong vòng 15-30 giây;, đọc kết quả và ghi chép lại kết quả.
e/Kỹ thuật gelcard để xác định kháng nguyên Fyb, S:
- Bước 1: Nhỏ 25 µl thuốc thử anti Fyb (hoặc anti S) vào một gelcard đã được ghi tên hoặc đánh số;
- Bước 2: Thêm 50 µl hồng cầu 1% cần định nhóm pha trong dung dịch scanliss; - Bước 3: Ủ ống nghiệm trên ở 37˚C/15phút bằng máy ủ chuyên dụng;
- Bước 4: Ly tâm 900 vòng/phút/10 phút bằng máy ly tâm chuyên dụng; - Bước 5: Nhận định kết quả
+ Phản ứng ngưng kết: Có kháng nguyên Fyb (hoặc S) trên bề mặt hồng cầu.
+ Phản ứng không ngưng kết: Không có kháng nguyên Fyb (hoặc S) trên bề mặt hồng cầu.
e/Kỹ thuật gelcard để xác định kháng nguyên k, Cw, Leb:
- Bước 1: Nhỏ 12 µl hồng cầu 5% cần định nhóm ( pha trong dung dịch scanliss) vào một gelcard đã có sẵn thuốc thử anti Leb (hoặc anti k và anti Cw);
- Bước 2: Ly tâm 900 vòng/phút/10 phút bằng máy ly tâm chuyên dụng; - Bước 3: Nhận định kết quả
+ Phản ứng ngưng kết: Có kháng nguyên k (hoặc Cw, Leb) trên bề mặt hồng cầu. + Phản ứng không ngưng kết: Không có kháng nguyên k (hoặc Cw, Leb) trên bề mặt hồng cầu.
f/ Kỹ thuật gelcard để xác định kháng nguyên M:
- Bước 1: Nhỏ 50 µl hồng cầu 1% cần định nhóm (pha trong dung dịch scanliss) vào một gelcard đã có sẵn thuốc thử anti M;
- Bước 2: Ủ ống nghiệm trên ở 22˚C/10phút;
- Bước 3: Ly tâm 900 vòng/phút/10 phút bằng máy ly tâm chuyên dụng; - Bước 4: Nhận định kết quả
+ Phản ứng ngưng kết: Có kháng nguyên M (hoặc Leb) trên bề mặt hồng cầu. + Phản ứng không ngưng kết: Không có kháng nguyên M (hoặc Leb) trên bề mặt hồng cầu.
g/ Kỹ thuật ngưng kết trên phiến kính xác định kháng nguyên N:
- Bước 1: Nhỏ 2 giọt thuộc thử anti N vào một ống nghiệm đã dán nhãn; - Bước 2: Thêm 1 giọt hồng cầu 5% cần định nhóm;
- Bước 3: Trộn đều hồng cầu cần định nhóm và thuốc thử để có đường kính 2 cm, lắc liên tục và đọc kết quả trong vòng 3 phút;
- Bước 4: Nhận định kết quả bằng mắt thường.
+ Phản ứng ngưng kết: Có kháng nguyên N trên bề mặt hồng cầu.
+ Phản ứng không ngưng kết: Không có kháng nguyên N trên bề mặt hồng cầu.
h/Kỹ thuật gelcard để xác định kháng nguyên P1:
- Bước 1: Rửa hồng cầu cần định nhóm bằng nước muối 0,9% và xử lý bằng enzyme papain;
- Bước 2: Pha hồng cầu đã được xử lý enzyme papain thành dung dịch hồng cầu 1% trong dung dịch scanliss;
- Bước 3: Nhỏ 25 µl thuốc thử anti Fyb (hoặc anti S) vào một gelcard đã được ghi tên hoặc đánh số;
- Bước 4: Thêm 50 µl hồng cầu 1% cần định nhóm được xử lý enzyme papain đã pha ở trên;
- Bước 5: Ủ ống nghiệm trên ở 37˚C/20phút bằng máy ủ chuyên dụng; - Bước 6: Ly tâm 900 vòng/phút x 10 phút bằng máy ly tâm chuyên dụng; - Bước 5: Nhận định kết quả
+ Phản ứng ngưng kết: Có kháng nguyên P1 (Fyb) trên bề mặt hồng cầu.
+ Phản ứng không ngưng kết: Không có kháng nguyên P1 (Fyb) trên bề mặt hồng cầu.
Các xét nghiệm trên được thực hiện tại khoa Huyết thanh học nhóm máu và sử dụng các trang thiết bị của khoa bao gồm: Máy ly tâm Kobuta của Nhật, máy rửa Coombs tự động Hitachi của Nhật, hệ thống máy ủ, ly tâm làm gelcard của hãng BIORAD và DIAMED, kính hiển vi Nikon của Nhật, tủ lạnh bảo quản sinh phẩm và mẫu máu, bình cách thủy Memmert của Đức …
2.2.3.4. Lựa chọn những người hiến máu nhóm O đã được xác định các kháng nguyên nhóm máu hệ hồng cầu để xây dựng panel hồng cầu
Những người hiến máu nhóm O được lựa chọn làm panel hồng cầu phải có đầy đủ các tiêu chuẩn sau:
• Là người hiến máu tình nguyện đạt tiêu chuẩn của người hiến máu theo quy định của quy chế truyền máu;
• Những người hiến máu này được tư vấn, giải thích về ý nghĩa nhân đạo và cần thiết của việc nghiên cứu;
• Không bị nhiễm các bệnh nhiễm trùng truyền qua đường máu: HIV, HBV, HCV, giang mai, sốt rét;
• Có bản cam kết đồng ý và tiếp tục hiến máu để làm panel hồng cầu trong tương lai;
• Đã được xác định các kháng nguyên nhóm máu hệ Rh, Kell, Duffy, Lewis, MNSs - Mia, P1, Lutheran và được quản lý trên máy tính bằng phần mềm excel.
2.2.3.5. Sử dụng Panel hồng cầu để sàng lọc kháng thể bất thường cho người hiến máu và bệnh nhân
a/Kỹ thuật ngưng kết trong ống nghiệm để sàng lọc kháng thể bất thường
Tùy thuộc vào số hồng cầu được chọn làm panel để chuẩn bị ống nghiệm làm xét nghiệm (thường là 3 hồng cầu).
Bước 1: Nhỏ vào 3 ống nghiệm đã được dán nhãn, mỗi ống nghiệm 2 giọt huyết thanh của bệnh nhân;
Bước 2: Thêm 1 giọt hồng cầu panel 5%tương ứng vào các ống nghiệm trên; Bước 3: Trộn đều;
Bước 4: Ly tâm 1000 vòng/ phút trong vòng 15-30 giây; Bước 5: Đọc và ghi lại kết quả;
Bước 6: Ủ tiếp ở 37˚C/ 30 phút;
Bước 7: Ly tâm 1000 vòng/ phút trong vòng 15-30 giây; Bước 8: Đọc, ghi lại kết quả;
Bước 9: Rửa hồng cầu 3 lần bằng nước muối 0,9%; Bước 10: Thêm 2 giọt kháng globulin;
Bước 11: Ly tâm 1000 vòng/ phút trong vòng 15-30 giây; Bước 12: Đọc và ghi lại kết quả;
Bước 13: Nếu kết quả âm tính thêm 1 giọt hồng cầu chứng (Hồng cầu nhóm O đã được cảm nhiễm anti D);
Bước 14: Ly tâm 1000 vòng/ phút trong vòng 15-30 giây; Bước 15: Đọc và ghi lại kết quả
- Kết quả phải dương tính
- Nếu kết quả âm tính phải lặp lại thử nghiệm.
Nhận định kết quả:
- Nếu kết quả một hoặc tất cả các điều kiện, nhiệt độ của phản ứng trên dương tính (ngưng kết) với 1 hoặc cả 3 hồng cầu panel => Bệnh nhân có thể có kháng thể bất thường.
- Nếu kết quả tất cả những điều kiện, nhiệt độ của phản ứng trên đều âm tính với cả 3 hồng cầu panel => Bệnh nhân không có kháng thể bất thường.
b/ Kỹ thuật gelcard để sàng lọc kháng thể bất thường ở 22°C và Coombs gián tiếp.
- Bước 1: Nhỏ 25 µl huyết thanh bệnh nhân vào 3 cột gel của một gelcard đã được ghi tên hoặc đánh số;
- Bước 2: Thêm vào mỗi cột gel đã được đánh số ở trên 50 µl hồng cầu 1% tương ứng với 3 hồng cầu panel sàng lọc kháng thể bất thường;
- Bước 3: Ủ gelcard trên ở 37˚C/15phút bằng máy ủ chuyên dụng hoặc ở 22°C/15 phút;
- Bước 4: Ly tâm 900 vòng/phút/10 phút bằng máy ly tâm chuyên dụng; - Bước 5: Nhận định kết quả
+ Phản ứng ngưng kết với cả 3 hoặc 1 trong số 3 hồng cầu panel: Trong huyết thanh của bệnh nhân có kháng thể bất thường.
+ Phản ứng không ngưng kết: Trong huyết thanh của bệnh nhân không có kháng thể bất thường.