23 Biến tính PNS bằng Gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE là chất mang 4)

1 5 Cơ chế mangthuốc hướng đích thụ động:

16 23 Biến tính PNS bằng Gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE là chất mang 4)

Nhằm để biến tính hiệu quả hạt silica, luận án tiến hành gắn nhómCOOH lên bề mặt hạt nano PNS-APTES bằng cách cho PNS-APTES phản ứng với anhydride succinic trong dung mơi aceton

Hình 1 21 Phản ứng tạo gắn anhidride succinic lên PNS (PNS-APTES-COOH)

Khi cho bề mặt của hạt silica có nhóm amino phản ứng với anhydride succinic trong điều kiện lạnh và pH khoảng 6–7 và dung môi DMF Phản ứng diễn ra theo cơ chế mở vòng anhydride succinic Đầu tiên, đơi điện tử của nhóm amino sẽ tác kích vào nhóm carbonyl, tiếp theo là sự di chuyển proton từ nitrogen đến oxygen của vòng tạo ra liên kết của amino và hình thành nhóm -COOH bên ngồi bề mặt hạt

Tổng hợ p PNS-APTES-COOH-GE

Để q trình biến tính đạt hiệu suất cao cho quá phản ứng biến tính nano silica cần hoạt hóa nhóm -COOH của PNS-APTES-COOH trước bằng 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC):

Hình 1 22 Phản ứng hoạt hóa PNS-APTES-succinic bằng EDC

Sau khi tiến hành hoạt hóa sẽ thực hiện q trình biến tính PNS-APTES-succinic với gelatin Q trình tạo liên kết PNS-APTES-Succinic với gelatin theo phản ứng sau:

Hình 1 23 Phản ứng tạo liên kết PNS-APTES-Anhydride succinic với gelatin 1 6 2 4 Biến tính PNS bằng Gelatin-mPEG (tổng hợp PNS-GEL-mPEG hay còn gọi là PNS-APTES-GEL-mPEG là chất mang 5)

Tổng hợ p Gelatin-mPEG

Nhằm mục đích tăng khả năng tan trong nước cũng như tăng tính tương hợp sinh học và duy trì thời gian thuốc lưu thơng trong cơ thể, nghiên cứu này tiến hành gắn mPEG cho Gelatin trước khi biến tính lên bề mặt silica Để tổng hợp được nano Gelatin-mPEG ta tiến hành 2 bước:

Hoạt hóa mPEG bằng p-nitrophenyl carbonate (NPC)

Phản ứng thế ái nhân (thân hạch) trên carbon của nhóm carbonyl diễn ra thuận lợi ở nhiệt độ 65C như phản ứng hình 2 6

Phản ứng xảy ra theo cơ chế tương tự như phản ứng ester hóa Trong cấu trúc của NPC, liên kết CO có tính chất khơng no và bị phân cực mạnh về phía oxygen, làm xuất hiện mật độ điện tích dương trên nguyên tử carbon, tạo ra trung tâm thiếu điện tử

Trong khi đó trên nguyên tử oxygen của nhómOH của phân tử mPEG cịn hai đơi điện tử tự do, nên ngun tử oxygen đóng vai trị như một tác nhân ái nhân (thân hạch) Trung tâm thiếu điện tử trên nguyên tử carbon của phân tử NPC gặp tác nhân ái nhân của phân tử mPEG sẽ tương tác với nhau tạo sản phẩm mPEG-NPC

Điều đáng chú ý là tác chất NPC và sản phẩm mPEG-NPC có hoạt tính rất mạnh, dễ bị thủy phân trong mơi trường nước, do đó để đạt được hiệu suất phản ứng cao thì phản ứng phải được thực hiện trong điều kiện khan nước, ở nhiệt độ thấp, trong mơi trường khí nitrogen; tác chất và dung môi phải được làm khan trước khi tiến hành phản ứng Để hạn chế sự thủy phân sản phẩm tạo thành, sản phẩm thu được phải được sấy khô trong tủ sấy chân khơng, bảo quản trong bình hút ẩm tránh ánh sáng và hơi ẩm trong khơng khí

Phản ứng gắn gelatin với mPEG

Ban đầu mPEG được cho tác dụng với NPC để thu được mPEG-NPC Tác chất này sau đó phản ứng với Gelatin để thu được sản phẩm Gelatin-mPEG

Trong phản ứng này, do Gelatin có cấu trúc khá lớn nên ảnh hưởng lập thể, vì vậy phải pha loãng Gelatin để đảm bảo sản phẩm tạo thành có nhiều liên kết amide nhất

Phương trình phản ứng:

Tổng hợ p PNS-APTES-Succinic-Ge-mPEG

Sau khi tiến hành hoạt hóa PNS-APTES- Anhydride succinic bằng EDC (hình 2 10), ta sẽ thực hiện phản ứng của PNS-APTES- Anhydride succinic với Gelatin-mPEG

Hình 1 25 Phản ứng tạo liên kết PNS-APTES-Anhydride succinic với Gelatin-mPEG

Sau khi q trình tổng hợp hồn thành, sản phẩm thu được sẽ là vật liệu có kích thước nano PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG (có thể gọi tắt là PNS-GEL-mPEG) Vật liệu này được tổng hợp với kích thước mong muốn là 20 nm < d < 100 nm, trong đó d là đường kính hạt Ngồi ra vật liệu được tổng hợp sẽ có cấu trúc dạng tổ ong nên sẽ có nhiều lỗ xốp, nhờ vậy khi thực hiện quá trình mang thuốc các hạt thuốc sẽ có thể được hấp phụ trên bề mặt vật liệu trong các lỗ xốp

1 6 2 5 Biến tính PNS bằng SS-CS-PEG (tổng hợp PNS-SS-CS-PEG hay cịn gọi PNS@CS- PEG là chất mang 6)

G ắn c ầu n ối disulfide, hình thành PNS-SS-COOH

Đầu tiên hạt nano silica xốp có kích thước thích hợp được biến tính lần lượt với tác nhân 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) để thu được PNS-APTES Tiếp theo, PNS-APTES phản ứng với 3,3’-dithiodipropionic acid PNS-SS-COOH dưới dạng hạt nano

Tổng hợ p PNS@CS-PEG (PNS-APTES-CS-PEG)

Các bước tổng hợp được thể hiện trong như sau: Bước 1: PNS-SS-COOH được hoạt hóa với EDC

Hình 1 27 Phản ứng hoạt hóa PNS-SS-COOH với EDC

Bước 2: PNS-SS-COOH sau khi hoạt hóa với EDC được phản ứng với CS-PEG

Hình 1 28 Phản ứng tổng hợp chất mang thuốc PNS@CS-PEG

1 7 Thử nghiệm độc tính tế bào (cytotoxicity test)

An tồn dược phẩm là yếu tố cực kỳ quan trọng Việc thử nghiệm độc tính tế bào là bước đầu khơng thể thiếu đối với việc nghiên cứu 1 loại vật liệu dẫn truyền thuốc[32, 52, 53]

Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào

Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2 1 Hóa chất và thiết bị

2 1 1 Hóa chất

Bảng 2 1 Tên hóa chất và nơi xuất xứ

Tên hóa chất

Cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) 1-Ethyl-3-(3-dimethylami

nopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)

Tetraethyl orthosilicate (TEOS) Gelatin

Chitosan Acid acetic

Succinic anhydride Diethyl ether

(3-aminopropyl)triethoxy silane (APTES) 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Ethanol Tetrahydrofuran Xuất xứ Merck Merck Merck Merck Trung Quốc Merck Merck Merck

Tây Ban Nha Merck Màng cellulose 6000-8000 và 3000-5000 Da Merck Dithiodipropionic acid (DTDP) 4-Nitrophenyl chloromate Doxorubicin (DOX) Fluorouracile (5-FU) Sodium hydroxide Acid clohydric Merck Merck Merck Merck Trung Quốc Trung Quốc

Vỏ trấu sạch

2 1 2 Dụng cụ

 Máy đánh siêu âm UP200Ht  Máy khuấy từ gia nhiệt  Tủ sấy KETDNG 101  Máy li tâm

 Bình tam giác, cốc thủy tinh  Phễu chiết, ống đong

Miền Tây

 Máy cô quay Strike 300  Cân điện tử EB35B-Pro  Máy tạo khí N2

 Máy đo pH AB15  Phễu lọc, bình cầu  Giấy đo pH, giấy lọc  Máy đo UV-vis

2 2 Thực nghiệm

2 2 1 Tổng hợp nano silica xốp và tạo cầu nối biến tính

2 2 1 1 Tổng hợp vật liệu nano silica xốp (PNS) bằng phương pháp sol-gel[54]

Nano silica xốp (porous nano silicas) được tổng hợp bằng phương pháp sol-gel sao cho kích thước hạt đồng đều dưới 100 nm Sử dụng chất hoạt động bề mặt

Cetyltrimethylamonium bromide (CTAB) như một tác nhân định hình cấu trúc lỗ xốp cho vật liệu nano, đây cũng có thể xem là khung sườn để TEOS có thể thủy phân và bao lấy tạo điều kiện cho việc hình thành các hạt nano silica xốp sau này

Hình 2 1 Mơ tả qui trình tổng hợp Porous nano silica (PNS)

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp này như nhiệt độ, tốc độ khuấy, xúc tác, hàm lượng tetraethyl orthosilicate (TEOS), lượng nước

Trên cơ sở đó, chúng tơi tiến hành khảo sát kích thước hạt dựa trên lượng NH3, TEOS, ethanol với tốc độ khuấy khoảng 350 vịng/phút, nhiệt độ 60oC

Hình 2 2 Sơ đồ qui trình tổng hợp nano silica xốp (PNS) bằng phương pháp sol-gel 2 2 1 2 Tổng hợp vật liệu nano silica xốp bằng phương pháp kết tủa [55]

X ử lý nhi ệ t v ỏ trấ u

Vỏ trấu được làm sạch bằng nước sau đó được phơi khơ tự nhiên và được xử lý nhiệt trong lò nung ở 700oC trong 10 giờ Sau khi xử lí nhiệt, sản phẩm thu được là tro trấu có màu trắng xám

Hồ tan tro trấu

10g tro trấu sẽ được hoà tan bằng dung dịch NaOH có nồng độ 2N và được khuấy trên bể khuấy từ (nhiệt độ là 100oC) trong thời gian 1giờ 30phút đến 2 giờ Sản phẩm sau khi hoà tan sẽ được lọc qua giấy lọc thu được dung dịch sodium silicate có màu vàng trong

Trung hịa dung d ịch sodium silicate

Dung dịch sodium silicate tiếp tục được trung hồ bằng dung dịch HCl có nồng độ 1,5N và được khuấy trên bể khuấy từ Ở giai đoạn trung hoà pH của dung dịch được điều chỉnh trong khoảng (pH 6 – 6,5) đến khi xuất hiện kết tủa thì dừng khuấy

Ly tâm tách ch ất r ắn, s ấy chân không thu đượ c sả n phẩm

Hỗn hợp sau khi trung hoà được cho vào ống nghiệm có nắp và ly tâm với tốc độ 4000 (vịng/phút) trong 20 phút để tách phần rắn Sau đó, sẽ được rửa sạch bằng nước cất ba lần (mỗi lần 5 mL) và hai lần bằng ethanol (mỗi lần 5 mL) Tiếp đến, đông khô trong 20 giờ để thu sản phẩm nano silica

Trình tự thí nghiệm được mơ tả qua hình sau:

Nung Nghiền n Trung hồ Lọc Đơng khơ

Hình 2 3 Qui trình tổng hợp nano silica xốp (PNS) bằng phương pháp kết tủa

tâ m Ly ta n H oà

2 2 1 3 Tạo cầu nối biến tính Tổng hợ p PNS-GPTMS

PNS gắn với (3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilane viết tắt là PNS-GPTMS với mục đích tạo nhóm hoạt hóa mạnh trên PNS để thuận tiện cho việc biến tính lên PNS Trong cơng thức cấu tạo của (3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) có vịng epoxid hoạt hóa rất mạnh Phản ứng tạo cầu nối GPTMS được thực hiện như sau:

Đánh siêu âm hỗn hợp gồm 1(g) PNS-CTAB và 30 mL dung dịch toluene trong vòng 1giờ Sau đó khuấy trong khoảng 30 phút ở nhiệt độ phịng trong mơi trường khí nitơ

Thêm từ từ 1 mL (3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilane vào hỗn hợp, tiếp tục cho phản ứng trong 12 giờ trong mơi trường khí nitơ, ở nhiệt độ phịng

Sau đó, tiến hành thẩm tách sản phẩm với màng cellulose (MW 6000-8000 Da) trong 250 mL hỗn hợp gồm acid acetic 2(M) và ethanol (1:1) Quá trình này thực hiện trong 5 lần Sau đó đơng khơ và thu được sản phẩm dạng bột mịn

Tổng hợ p PNS-APTES

Các hạt nano PNS-APTES cũng được tổng hợp bằng phương pháp sol-gel, sử dụng APTES như nguồn cung cấp -NH2 cho bề mặt hạt nano silica xốp Phương pháp tổng hợp PNS-APTES cũng có phần tương đồng với quy trình tổng hợp nano silica PNS (xem qui trình ở hình 2 5)

Hình 2 5 Sơ đồ tổng hợp PNS-APTES

Đầu tiên, khuấy hỗn hợp gồm 64 mL nước deion và 2,6g Cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) ở 60oC trong 30 phút Sau đó thêm từ từ hai dung dịch gồm 11,25 mL ethanol và 550 µL NH3 (2,8%) vào hỗn hợp, khuấy trong vòng 5 phút với tốc độ vòng là 300 vòng/phút

Chuẩn bị 8 mL tetraethylorthosilicate (TEOS), nhỏ cẩn thận vào hỗn hợp bằng kim tiêm Giữ phản ứng trong 2 giờ (tính từ lúc nhỏ hết TEOS) Sau đó lấy mẫu ra ngâm vào nước lạnh, đánh siêu âm trong 30 phút

Sau khi đánh siêu âm, nhỏ từ từ, cùng lúc 4mL ethanol và 1mL APTES Khuấy hỗn hợp trên trong 20 giờ ở 30oC Sau đó đem mẫu siêu âm trong 30 phút

Dung dịch thu được đem thẩm tách bằng màng cellulose (MW 6 000-8 000 Da) trong nước trong 3 ngày, tiếp tục thẩm tách trong 250 mL hỗn hợp gồm acid acetic 2(M) và ethanol (1:1) Quá trình này thực hiện trong 5 lần

Dung dịch thu được đem đông khô, thu được sản phẩm dạng bột màu trắng, mịn

2 2 2 Biến tính vật liệu nano silica xốp

2 2 2 1 Biến tính bằng hydrazine (tổng hợp PNS-GPTMS-Hydrazine là chất mang thuốc 1)

PNS-GPTMS hịa tan hồn trong nước khử ion sau đó nhỏ từ từ hỗn hợp trên vào hydrazine và phản ứng 12 giờ trong điều kiện khuấy từ ở nhiệt độ phòng

Sản phẩm được đưa vào màng (MW 12kD-14kDa) và thẩm tách trong nước cất khoảng 3 ngày, sau đó đơng khơ thu sản phẩm

Hình 2 6 Quy trình tổng hợp PNS-GPTMS-Hydrazine

2 2 2 2 Biến tính PNS bằng Chitosan-mPEG (tổng hợp PNS-GPTMS-CS-mPEG là chấtmang thuốc 2) mang thuốc 2)

Tổng hợ p Chitosan-mPEG

- Cân 0,25g mPEG (5000Da) cho vào bình cầu 3 cổ và sau đó gia nhiệt lên 65-70oC cho mPEG chảy ra Trong quá trình gia nhiệt cần hút chân không để tạo môi trường chân không cho phản ứng

- Sau khi mPEG chảy ra hồn tồn thì cân 16,00mg NPC (201 56Da) cho vào Khi cân NPC thì lưu ý vì NPC khá nhạy với nước nên thao tác cần nhanh để tránh trường hợp NPC bị thủy phân Để hệ phản ứng ổn định ở nhiệt độ từ 65-70˚C, trong môi trường chân không trong vòng 6 giờ, tốc độ khuấy 300 vòng/phút

- Sau 6 giờ phản ứng ở nhiệt độ 65-70oC, hạ nhiệt độ hệ phản ứng xuống 40˚C Cho tiếp vào 5 mL THF vào và tiếp tục khuấy ở tốc độ 300 (vòng/phút) trong khoảng hơn 1giờ Rửa hỗn hợp phản ứng bằng diethyl ether 3 lần (mỗi lần 10 mL) Gạn bỏ phần nước phía trên và thu lấy phần chất rắn trắng kết tủa phía dưới Tiếp theo đem cô quay phần chất rắn trắng để loại bỏ hết dung mơi hữu cơ Thu được mPEG đã hoạt hóa

Hình 2 7 Hoạt hóa mPEG bằng NPC

Tổng hợp CS-mPEG

-

-

-

Nhỏ từng giọt dung dịch mPEG đã hoạt hóa vào dung dịch chitosan theo tỉ lệ khối lượng 1:5, khuấy 300 rpm trong vòng 24 giờ

Dung dịch CS-mPEG thu được sẽ được thẩm tách bằng màng (MW 12-14 000 Da) trong nước cất 4 ngày

Đông cô dung dịch mPEG-chitosan thu được sản phẩm

Hình 2 8 Qui trình tổng hợp Chitosan-mPEG Tạo liên k ế t gi ữ a PNS-GPTMS và CS-mPEG

Phản ứng của chitosan lên bề mặt của nano silica vừa biến tính hồn tồn có thể tạo ra nhờ khả năng hoạt động mạnh của vòng epoxy trong pH cao lẫn pH thấp Tuy nhiên để chọn lựa pH như thế nào để CS-mPEG vẫn còn giữ được liên kết amide sau phản ứng là vấn đề đáng chú ý

Trong luận án này, pH khoảng 3 đến 4 được lựa chọn, vì ở pH này liên kết amide này không bị thủy phân

PNS-GPTMS được phân tán trong 15 mL H2O, đánh siêu âm trong 30 phút, điều chỉnh pH=3,5

CS-mPEG được hòa tan trong 20 mL H2O, điều chỉnh pH 3,5 sau đó khuấy từ khoảng 30 phút

Cho từ từ dung dịch CS-mPEG vào PNS-GPTMS, cho phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 36 giờ Hỗn hợp được li tâm và rửa lại 3 lần với nước cất Đơng khơ, thu được sản phẩm

Hình 2 9 Qui trình tổng hợp PNS-GPTMS-CS-mPEG

2 2 2 3 Biến tính bằng gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE là chất mang 4) Tổng hợ p PNS-APTES-Succinic Anhydride (PNS-APTES-COOH)

Đầu tiên 0,2g PNS-APTES hòa tan trong 10mL aceton và 5g anhydrid succinic hòa tan trong acetone 20mL, khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ

Sau đó bay hơi chân khơng quay ở nhiệt độ 40oC để thu được PNS-APTES-COOH

Tổng hợ p PNS-APTES-Succinic-Gelatin (PNS-APTES-COOH-GE)

Cho 0,3 g gelatin phân tán trong 5 mL nước trong 1 giờ, điều chỉnh pH 7,4

Cân 0,2 g PNS-APTES-COOH vào 75 mL nước, khuấy khoảng 50 phút, điều chỉnh pH 3,5 Sau đó, cho 10 μL EDC vào, tiếp tục khuấy thêm khoảng 10 phút

Cho từ từ dung dịch gelatin vào dung dịch PNS-APTES-COOH, cho phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ

Hỗn hợp được thẩm tách và đông khô, thu được sản phẩm cuối cùng dạng bột, màu trắng, mịn là hệ mang thuốc

Hình 2 11 Qui trình tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE

2 2 2 4 Biến tính PNS bằng gelatin-mPEG (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG hay còn gọi là PNS -GEL-mPEG là chất mang thuốc 5)

Sau khi biến tính PNS với gelatin, nghiên cứu tiếp tục phát triểnbằng cách gắn thêm mPEG lêngelatintrước khi biến tính lên bề mặt nano silica xốp (PNS) nhằm mục đích tăng khả năng tan trong nước cũng như tăng tính tương hợp sinh học và duy trì thời gian thuốc lưu thơng của thuốc trong cơ thể

Tổng hợ p gelatin-mPEG

Qui trìnhtổng hợp gelatin-mPEGđược tiến hành 2 bước: Hoạt hóa mPEG bằng p-nitrophenyl carbonate (NPC)

Hình 2 12 Hoạt hóa mPEG bằng NPC

- Cân 0,25g mPEG (5 000 Da) cho vào bình cầu 3 cổ và sau đó gia nhiệt lên 65-70˚C cho mPEG chảy ra Trong quá trình gia nhiệt cần hút chân không để tạo môi trường chân