1 5 Cơ chế mangthuốc hướng đích thụ động:
17 Thử nghiệm độc tính tế bào (cytotoxicity test)
An toàn dược phẩm là yếu tố cực kỳ quan trọng Việc thử nghiệm độc tính tế bào là bước đầu không thể thiếu đối với việc nghiên cứu 1 loại vật liệu dẫn truyền thuốc[32, 52, 53]
Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào
Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hịa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2 1 Hóa chất và thiết bị
2 1 1 Hóa chất
Bảng 2 1 Tên hóa chất và nơi xuất xứ
Tên hóa chất
Cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) 1-Ethyl-3-(3-dimethylami
nopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)
Tetraethyl orthosilicate (TEOS) Gelatin
Chitosan Acid acetic
Succinic anhydride Diethyl ether
(3-aminopropyl)triethoxy silane (APTES) 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Ethanol Tetrahydrofuran Xuất xứ Merck Merck Merck Merck Trung Quốc Merck Merck Merck
Tây Ban Nha Merck Màng cellulose 6000-8000 và 3000-5000 Da Merck Dithiodipropionic acid (DTDP) 4-Nitrophenyl chloromate Doxorubicin (DOX) Fluorouracile (5-FU) Sodium hydroxide Acid clohydric Merck Merck Merck Merck Trung Quốc Trung Quốc
Vỏ trấu sạch
2 1 2 Dụng cụ
Máy đánh siêu âm UP200Ht Máy khuấy từ gia nhiệt Tủ sấy KETDNG 101 Máy li tâm
Bình tam giác, cốc thủy tinh Phễu chiết, ống đong
Miền Tây
Máy cô quay Strike 300 Cân điện tử EB35B-Pro Máy tạo khí N2
Máy đo pH AB15 Phễu lọc, bình cầu Giấy đo pH, giấy lọc Máy đo UV-vis
2 2 Thực nghiệm
2 2 1 Tổng hợp nano silica xốp và tạo cầu nối biến tính
2 2 1 1 Tổng hợp vật liệu nano silica xốp (PNS) bằng phương pháp sol-gel[54]
Nano silica xốp (porous nano silicas) được tổng hợp bằng phương pháp sol-gel sao cho kích thước hạt đồng đều dưới 100 nm Sử dụng chất hoạt động bề mặt
Cetyltrimethylamonium bromide (CTAB) như một tác nhân định hình cấu trúc lỗ xốp cho vật liệu nano, đây cũng có thể xem là khung sườn để TEOS có thể thủy phân và bao lấy tạo điều kiện cho việc hình thành các hạt nano silica xốp sau này
Hình 2 1 Mơ tả qui trình tổng hợp Porous nano silica (PNS)
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp này như nhiệt độ, tốc độ khuấy, xúc tác, hàm lượng tetraethyl orthosilicate (TEOS), lượng nước
Trên cơ sở đó, chúng tơi tiến hành khảo sát kích thước hạt dựa trên lượng NH3, TEOS, ethanol với tốc độ khuấy khoảng 350 vịng/phút, nhiệt độ 60oC
Hình 2 2 Sơ đồ qui trình tổng hợp nano silica xốp (PNS) bằng phương pháp sol-gel 2 2 1 2 Tổng hợp vật liệu nano silica xốp bằng phương pháp kết tủa [55]
X ử lý nhi ệ t v ỏ trấ u
Vỏ trấu được làm sạch bằng nước sau đó được phơi khô tự nhiên và được xử lý nhiệt trong lò nung ở 700oC trong 10 giờ Sau khi xử lí nhiệt, sản phẩm thu được là tro trấu có màu trắng xám
Hồ tan tro trấu
10g tro trấu sẽ được hồ tan bằng dung dịch NaOH có nồng độ 2N và được khuấy trên bể khuấy từ (nhiệt độ là 100oC) trong thời gian 1giờ 30phút đến 2 giờ Sản phẩm sau khi hoà tan sẽ được lọc qua giấy lọc thu được dung dịch sodium silicate có màu vàng trong
Trung hòa dung d ịch sodium silicate
Dung dịch sodium silicate tiếp tục được trung hồ bằng dung dịch HCl có nồng độ 1,5N và được khuấy trên bể khuấy từ Ở giai đoạn trung hoà pH của dung dịch được điều chỉnh trong khoảng (pH 6 – 6,5) đến khi xuất hiện kết tủa thì dừng khuấy
Ly tâm tách ch ất r ắn, s ấy chân không thu đượ c sả n phẩm
Hỗn hợp sau khi trung hoà được cho vào ống nghiệm có nắp và ly tâm với tốc độ 4000 (vòng/phút) trong 20 phút để tách phần rắn Sau đó, sẽ được rửa sạch bằng nước cất ba lần (mỗi lần 5 mL) và hai lần bằng ethanol (mỗi lần 5 mL) Tiếp đến, đông khô trong 20 giờ để thu sản phẩm nano silica
Trình tự thí nghiệm được mơ tả qua hình sau:
Nung Nghiền n Trung hồ Lọc Đơng khơ
Hình 2 3 Qui trình tổng hợp nano silica xốp (PNS) bằng phương pháp kết tủa
tâ m Ly ta n H oà
2 2 1 3 Tạo cầu nối biến tính Tổng hợ p PNS-GPTMS
PNS gắn với (3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilane viết tắt là PNS-GPTMS với mục đích tạo nhóm hoạt hóa mạnh trên PNS để thuận tiện cho việc biến tính lên PNS Trong cơng thức cấu tạo của (3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) có vịng epoxid hoạt hóa rất mạnh Phản ứng tạo cầu nối GPTMS được thực hiện như sau:
Đánh siêu âm hỗn hợp gồm 1(g) PNS-CTAB và 30 mL dung dịch toluene trong vịng 1giờ Sau đó khuấy trong khoảng 30 phút ở nhiệt độ phịng trong mơi trường khí nitơ
Thêm từ từ 1 mL (3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilane vào hỗn hợp, tiếp tục cho phản ứng trong 12 giờ trong môi trường khí nitơ, ở nhiệt độ phịng
Sau đó, tiến hành thẩm tách sản phẩm với màng cellulose (MW 6000-8000 Da) trong 250 mL hỗn hợp gồm acid acetic 2(M) và ethanol (1:1) Quá trình này thực hiện trong 5 lần Sau đó đơng khơ và thu được sản phẩm dạng bột mịn
Tổng hợ p PNS-APTES
Các hạt nano PNS-APTES cũng được tổng hợp bằng phương pháp sol-gel, sử dụng APTES như nguồn cung cấp -NH2 cho bề mặt hạt nano silica xốp Phương pháp tổng hợp PNS-APTES cũng có phần tương đồng với quy trình tổng hợp nano silica PNS (xem qui trình ở hình 2 5)
Hình 2 5 Sơ đồ tổng hợp PNS-APTES
Đầu tiên, khuấy hỗn hợp gồm 64 mL nước deion và 2,6g Cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) ở 60oC trong 30 phút Sau đó thêm từ từ hai dung dịch gồm 11,25 mL ethanol và 550 µL NH3 (2,8%) vào hỗn hợp, khuấy trong vòng 5 phút với tốc độ vòng là 300 vòng/phút
Chuẩn bị 8 mL tetraethylorthosilicate (TEOS), nhỏ cẩn thận vào hỗn hợp bằng kim tiêm Giữ phản ứng trong 2 giờ (tính từ lúc nhỏ hết TEOS) Sau đó lấy mẫu ra ngâm vào nước lạnh, đánh siêu âm trong 30 phút
Sau khi đánh siêu âm, nhỏ từ từ, cùng lúc 4mL ethanol và 1mL APTES Khuấy hỗn hợp trên trong 20 giờ ở 30oC Sau đó đem mẫu siêu âm trong 30 phút
Dung dịch thu được đem thẩm tách bằng màng cellulose (MW 6 000-8 000 Da) trong nước trong 3 ngày, tiếp tục thẩm tách trong 250 mL hỗn hợp gồm acid acetic 2(M) và ethanol (1:1) Quá trình này thực hiện trong 5 lần
Dung dịch thu được đem đông khô, thu được sản phẩm dạng bột màu trắng, mịn
2 2 2 Biến tính vật liệu nano silica xốp
2 2 2 1 Biến tính bằng hydrazine (tổng hợp PNS-GPTMS-Hydrazine là chất mang thuốc 1)
PNS-GPTMS hịa tan hồn trong nước khử ion sau đó nhỏ từ từ hỗn hợp trên vào hydrazine và phản ứng 12 giờ trong điều kiện khuấy từ ở nhiệt độ phòng
Sản phẩm được đưa vào màng (MW 12kD-14kDa) và thẩm tách trong nước cất khoảng 3 ngày, sau đó đơng khơ thu sản phẩm
Hình 2 6 Quy trình tổng hợp PNS-GPTMS-Hydrazine
2 2 2 2 Biến tính PNS bằng Chitosan-mPEG (tổng hợp PNS-GPTMS-CS-mPEG là chấtmang thuốc 2) mang thuốc 2)
Tổng hợ p Chitosan-mPEG
- Cân 0,25g mPEG (5000Da) cho vào bình cầu 3 cổ và sau đó gia nhiệt lên 65-70oC cho mPEG chảy ra Trong q trình gia nhiệt cần hút chân khơng để tạo môi trường chân không cho phản ứng
- Sau khi mPEG chảy ra hồn tồn thì cân 16,00mg NPC (201 56Da) cho vào Khi cân NPC thì lưu ý vì NPC khá nhạy với nước nên thao tác cần nhanh để tránh trường hợp NPC bị thủy phân Để hệ phản ứng ổn định ở nhiệt độ từ 65-70˚C, trong mơi trường chân khơng trong vịng 6 giờ, tốc độ khuấy 300 vòng/phút
- Sau 6 giờ phản ứng ở nhiệt độ 65-70oC, hạ nhiệt độ hệ phản ứng xuống 40˚C Cho tiếp vào 5 mL THF vào và tiếp tục khuấy ở tốc độ 300 (vòng/phút) trong khoảng hơn 1giờ Rửa hỗn hợp phản ứng bằng diethyl ether 3 lần (mỗi lần 10 mL) Gạn bỏ phần nước phía trên và thu lấy phần chất rắn trắng kết tủa phía dưới Tiếp theo đem cô quay phần chất rắn trắng để loại bỏ hết dung môi hữu cơ Thu được mPEG đã hoạt hóa
Hình 2 7 Hoạt hóa mPEG bằng NPC
Tổng hợp CS-mPEG
-
-
-
Nhỏ từng giọt dung dịch mPEG đã hoạt hóa vào dung dịch chitosan theo tỉ lệ khối lượng 1:5, khuấy 300 rpm trong vòng 24 giờ
Dung dịch CS-mPEG thu được sẽ được thẩm tách bằng màng (MW 12-14 000 Da) trong nước cất 4 ngày
Đông cơ dung dịch mPEG-chitosan thu được sản phẩm
Hình 2 8 Qui trình tổng hợp Chitosan-mPEG Tạo liên k ế t gi ữ a PNS-GPTMS và CS-mPEG
Phản ứng của chitosan lên bề mặt của nano silica vừa biến tính hồn tồn có thể tạo ra nhờ khả năng hoạt động mạnh của vòng epoxy trong pH cao lẫn pH thấp Tuy nhiên để chọn lựa pH như thế nào để CS-mPEG vẫn còn giữ được liên kết amide sau phản ứng là vấn đề đáng chú ý
Trong luận án này, pH khoảng 3 đến 4 được lựa chọn, vì ở pH này liên kết amide này không bị thủy phân
PNS-GPTMS được phân tán trong 15 mL H2O, đánh siêu âm trong 30 phút, điều chỉnh pH=3,5
CS-mPEG được hòa tan trong 20 mL H2O, điều chỉnh pH 3,5 sau đó khuấy từ khoảng 30 phút
Cho từ từ dung dịch CS-mPEG vào PNS-GPTMS, cho phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 36 giờ Hỗn hợp được li tâm và rửa lại 3 lần với nước cất Đông khô, thu được sản phẩm
Hình 2 9 Qui trình tổng hợp PNS-GPTMS-CS-mPEG
2 2 2 3 Biến tính bằng gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE là chất mang 4) Tổng hợ p PNS-APTES-Succinic Anhydride (PNS-APTES-COOH)
Đầu tiên 0,2g PNS-APTES hòa tan trong 10mL aceton và 5g anhydrid succinic hòa tan trong acetone 20mL, khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ
Sau đó bay hơi chân không quay ở nhiệt độ 40oC để thu được PNS-APTES-COOH
Tổng hợ p PNS-APTES-Succinic-Gelatin (PNS-APTES-COOH-GE)
Cho 0,3 g gelatin phân tán trong 5 mL nước trong 1 giờ, điều chỉnh pH 7,4
Cân 0,2 g PNS-APTES-COOH vào 75 mL nước, khuấy khoảng 50 phút, điều chỉnh pH 3,5 Sau đó, cho 10 μL EDC vào, tiếp tục khuấy thêm khoảng 10 phút
Cho từ từ dung dịch gelatin vào dung dịch PNS-APTES-COOH, cho phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ
Hỗn hợp được thẩm tách và đông khô, thu được sản phẩm cuối cùng dạng bột, màu trắng, mịn là hệ mang thuốc
Hình 2 11 Qui trình tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE
2 2 2 4 Biến tính PNS bằng gelatin-mPEG (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG hay còn gọi là PNS -GEL-mPEG là chất mang thuốc 5)
Sau khi biến tính PNS với gelatin, nghiên cứu tiếp tục phát triểnbằng cách gắn thêm mPEG lêngelatintrước khi biến tính lên bề mặt nano silica xốp (PNS) nhằm mục đích tăng khả năng tan trong nước cũng như tăng tính tương hợp sinh học và duy trì thời gian thuốc lưu thông của thuốc trong cơ thể
Tổng hợ p gelatin-mPEG
Qui trìnhtổng hợp gelatin-mPEGđược tiến hành 2 bước: Hoạt hóa mPEG bằng p-nitrophenyl carbonate (NPC)
Hình 2 12 Hoạt hóa mPEG bằng NPC
- Cân 0,25g mPEG (5 000 Da) cho vào bình cầu 3 cổ và sau đó gia nhiệt lên 65-70˚C cho mPEG chảy ra Trong quá trình gia nhiệt cần hút chân không để tạo môi trường chân không cho phản ứng
- Sau khi mPEG chảy ra hồn tồn thì cân 16 mg NPC (201 56 Da) cho vào Khi cân NPC thì lưu ý vì NPC khá nhạy với nước nên thao tác cần nhanh để tránh trường hợp NPC bị thủy phân Để hệ phản ứng ổn định ở nhiệt độ từ 65-70˚C, trong môi trường chân khơng trong vịng 6 giờ, tốc độ khuấy 300 vòng/phút
- Sau 6 giờ phản ứng ở nhiệt độ 65-70˚C, hạ nhiệt độ hệ phản ứng xuống 40˚C Cho tiếp vào 5 mL THF vào và tiếp tục khuấy ở tốc độ 300 vòng/phút trong khoảng hơn 1giờ
- Rửa hỗn hợp phản ứng bằng diethyl ether 3 lần Gạn bỏ phần nước phía trên và thu lấy phần chất rắn trắng kết tủa phía dưới Tiếp theo đem cô quay phần chất rắn trắng để loại bỏ hết dung môi hữu cơ Thu được mPEG đã hoạt hóa
Ban đầu mPEG được hoạt hóa bằng cách cho tác dụng với NPC để thu được mPEG- NPC Tác chất này sau đó phản ứng với Gelatin để thu được sản phẩm Gelatin-mPEG
Trong phản ứng này, do gelatin có cấu trúc khá lớn nên ảnh hưởng lập thể, vì vậy phải pha lỗng gelatin
Qui trình thực hiện như sau:
- Dung dịch Gelatin được hòa tan trong nước
- Nhỏ từng giọt dung dịch mPEG đã hoạt hóa vào dung dịch Gelatin theo tỉ lệ khối lượng 1:5, khuấy 300 rpm trong vòng 24 giờ
- Dung dịch Gelatin-mPEG thu được sẽ được thẩm tách bằng màng (MW 12 000- 14 000 Da) trong nước cất 3 ngày
- Đông cô dung dịch Gelatin-mPEG thu được sản phẩm dạng bột, màu trắng
Hình 2 13 Qui trình tổng hợp Gelatin-mPEG
Tổng hợ p PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG (PNS-APTES-Succinic-Gelatin-mPEG)
Cho 0,3 g Gelatin-mPEG phân tán trong 5 mL nước trong 1 giờ, điều chỉnh pH 7,4 Thu được dung dịch A
Cân 0,2 g PNS-APTES-COOH vào 75 mL nước, khuấy khoảng 50 phút, điều chỉnh pH 3,5 Sau đó, cho 10 μL EDC vào, tiếp tục khuấy thêm khoảng 10 phút Thu được dung dịch B
Hỗn hợp được thẩm tách và đông khô, thu được sản phẩm cuối cùng dạng bột, màu trắng, mịn là hệ mang thuốc
Hình 2 14 Qui trình tổng hợp PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG
Sau khi q trình tổng hợp hồn thành, sản phẩm thu được sẽ là vật liệu có kích thước nano PNS-APTES-COOH-Ge-mPEG (có thể gọi tắt là PNS-Ge-mPEG) Vật liệu này được tổng hợp với kích thước mong muốn là 20nm < d < 100nm, trong đó d là đường kính hạt Ngồi ra vật liệu được tổng hợp sẽ có cấu trúc dạng tổ ong nên sẽ có nhiều lỗ xốp, nhờ vậy khi thực hiện quá trình mang thuốc các hạt thuốc sẽ có thể được hấp phụ trên bề mặt vật liệu trong các lỗ xốp
2 2 2 5 Biến tính bằng SS-CS-PEG (tổng hợp PNS-SS-CS-PEG (là chất mang thuốc 6) G ắn c ầu n ối disulfide, hình thành PNS-SS-COOH
Cho 1 g PNS-APTES vào cốc 100mL có chứa sẵn 20mL nước deion, khuấy đều 30 phút, sau đó thêm vào 0,14mL EDC trước khi tiến hành phản ứng 5 phút (cốc 1)
Cho 0,16g DTDP vào cốc 50mL có chứa sẵn 20mL DMF, khuấy đều đến tan (cốc 2) Cho cốc (2) vào (1) và tiến hành phản ứng 24 giờ
Cho dung dịch vào màng 6 – 8 kDa và thẩm tách 4 ngày trong nước cất Đem dung dịch thu được đi đông khô, ta thu được PNS-SS-COOH
Lưu ý: Tất cả các quá trình được thực hiện ở nhiệt độ phịng, tốc độ khuấy duy trì ở 300
Tổng hợ p PNS@CS-PEG
Cho 150 mg PNS-SS-COOH hòa tan trong 20 mL nước deion, khuấy đều 30 phút ở tốc độ 300 rpm, nhiệt độ phòng Điều chỉnh pH của dung dịch PNS-SS-COOH trong khoảng pH 4-5 bằng dung dịch HCl hoặc NaOH
Thêm 50µg/L EDC (1-3 Dimethylamino-5-ethyl carbodimide) vào để hoạt hóa nhóm COOH trong 15 phút
Cho 10 mL dung dịch CS-PEG (108 mg) vào và thực hiện phản ứng 24 giờ ở nhiệt độ phòng trong điều kiện N2
Thẩm tách bằng màng 6–8 kDa trong môi trường nước 4 ngày Dung dịch được đem đông khô và thu được PNS-SS-CS-PEG
2 2 3 Khảo sát q trình mang giải phóng của vật liệu
2 2 3 1 Khảo sát quá trình mang thuốc 5-FU và giải phóngthuốc Tiế n hành mang thu ốc 5-FU
Phương pháp 1[56]:
- Hòa tan riêng lẻ thuốc và chất mang vào nước khử ion thành 2 dung dịch riêng Khuấy và siêu âm tạo 2 hỗn hợp cho đồng nhất trong khoảng 30 phút
- Cho từ từ hỗn hợp thuốc vào chất mang Duy trì khuấy từ trong khoảng thời gian cho thuốc vào Tiếp tục khuấy trong 24 giờ
- Tiến hành chia ra 6 màng để thẩm tách loại thuốc tự do
- Đo HPLC để xác định thuốc chưa mang nhận thấy với phương pháp này không thể mang được thuốc 5-FU vào vật liệu nano silica dù đã thử nhiều lần với tất cả chất mang được biến tính, hút chân khơng cẩn thận chất mang trước khi mang thuốc…
Với khó khăn trên, chúng tơi tìm cách mang được thuốc 5-FU vào vật liệu bằng cách bắt chước nguyên lý của sắc ký cột, dùng áp lực nén thuốc vào chất mang Phương pháp này xin