chưa qua chế biến
Xác định chỉ tiêu hiếu khí trong thực phẩm áp dụng theo TCVN 4884 : 2005 ISO 4833 : 2003 [4].
-Nguyên tắc
Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch Plate Count Agar (PCA) có pH = 7,2±0,2, sau khi ủ hiếu khí ở 37°C trong 48 giờ. Số lượng TSVSVHK có trong 1g mẫu được tính theo số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa thạch nuôi cấy theo các nồng độ pha loãng khác nhau.
-Môi trường hóa chất:
+ Môi trường thạch Plate Count Agar (PCA) có pH = 7,0±0,2. + Dung dịch pha loãng nước muối sinh lý
-Cách tiến hành
+ Pha loãng và đồng nhất mẫu:
Thịt lợn và thịt gà lấy ngẫu nhiên ở những vị trí khác nhau, mẫu được căt nhỏ và cân chính xác 5g mẫu cho vào ống hoặc bình tam giác có chứa sẵn 45ml nước muối pha loãng. Sau đó lắc đều trong thời gian từ 2-3 phút cho mẫu đồng nhất trong dung dịch pha loãng. Ta thu được mẫu thử có đậm độ pha loãng là 10-1
Tiếp tục pha loãng mẫu bằng cách dùng pipet hút chính xác 1ml mẫu thử ở nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm có chứa 9ml dung dịch pha loãng ta thu được mẫu thử ở đậm độ 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có những đậm độ pha loãng tiếp theo. Cho đến khi được dung dịch mẫu có độ pha loãng cần thiết. Cần căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn của mẫu để tiến hành pha loãng dung dịch mẫu tới các độ pha loãng phù hợp.
+ Đổ đĩa:
Mẫu kiểm nghiệm được nuôi cấy ở ít nhất 3 đậm độ liên tiếp, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa môi trường.
Dùng pipet hút 1ml dung dịch mẫu pha loãng ở các nồng độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa.
Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ± 1°C trong điều kiện vô khuẩn, rót vào từng đĩa khoảng 12 - 15 ml môi trường thạch PCA. Trộn đều dung dịch mẫu thử với thạch bằng cách lắc đều sang trái, sang phải, lên trên và xuống dưới mỗi chiều 3 lần. Đặt các đĩa trên mặt phẳng nằm ngang để cho môi trường đông tự nhiên. Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút.
Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên bề mặt.
Khi thạch đã đông, lật úp các đĩa petri, sau đó cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong thời gian 24-48 giờ
+ Đọc kết quả:
Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức. Đếm toàn bộ số khuẩn lạc và tính kết quả chính thức.
Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả không hợp lý thì phải tiến hành lại các bước nuôi cấy.
+ Tính kết quả:
• Chọn những đĩa có từ 15-300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp. Nếu chênh lệch giá trị ở 2 đậm độ trên nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, tính số (N)khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí cho 1g(ml) sản phẩm bằng cách tính trung bình cộng tổng số có khuẩn lạc của các đĩa trên theo công thức sau:
∑C N =
(n1 + 0,1 n2).d Trong đó:
C : Số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn
N1, n2 : Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn ở đĩa thứ 1, thứ 2 D : Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1
Sau đó làm tròn số kết quả có được chỉ giữ lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n( n là số mũ thích hợp của 10).
• Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị pha loãng thấp hơn để tính theo trung bình cộng
Ví dụ:
Ở đậm độ pha loãng 10-2 có 180 và 250 khuẩn lạc Ở đậm độ pha loãng 10-3 có 60 và 75 khuẩn lạc Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn 10-2 để tính kết quả 180+250
N = = 21500
2 × 10-2
Kết quả: 2,0×102 vi khuẩn hiếu khí trong 1g hoặc 1ml sản phẩm
• Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc ở đậm độ pha loãng ban đầu (10-1) có ít hơn 15 khuẩn lạc, tính kết quả theo trung bình cộng các khuẩn lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính cho 1g hay 1ml sản phẩm.
Ví dụ:
Chỉ ở đậm độ pha loãng 10-1 của sản phẩm đặc có 12 và 8 khuẩn lạc. Ở đậm độ pha loãng 10-3 có 60 và 75 khuẩn lạc.
Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn 10-2 để tính kết quả. 12 + 8
N = = 100
2 ×10-1
Kết quả: 1,0 × 102 vi khuẩn hiếu khí trong 1g hoặc 1ml sản phẩm.
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập tổng số vi sinh vật hiếu khí
1ml 1ml 25g mẫu 225ml BPW 9ml BPW 9ml BPW 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 1ml 12-15ml thạch PCA 12-15ml thạch PCA 12-15ml thạch PCA Ủ ấm 30° C/72h ± 3°C Tính toán kết quả