Xác định chỉ tiêu E. coli áp dụng theo TCVN 6846 : 2007 ISO 7251 : 2005 [3]. -Nguyên tắc
Kỹ thuật này tiến hành theo phương pháp MPN và sử dụng bảng chỉ số MPN để tính kết quả. Tổng số E. coli có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm thực phẩm được xác định bằng số ống dương tính sau khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và tính số xác suất lớn nhất (MPN) sau khi ủ ở 37°C, rồi cấy chuyển sang các môi trường EC và Pepton kiềm ủ ở 44°C trong 24 - 48 giờ, cho thử nghiệm sinh Indol dương tính.
-Môi trường và hóa chất
+ Môi trường được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn E.coli là môi trường canh thang Trypton Lauryl Sunfat
+ Canh thang EC: Dùng để cấy chuyển E. coli + Nước pepeton kiềm không chứa Indol + Thuốc thử Kovacs: Thử khả năng sinh Indol -Các bước tiến hành
+ Pha loãng mẫu
Cân chính xác 5g thịt gà và 5g thịt lợn mỗi loại cho vào 1 ống hoặc bình nón có có chứa sẵn 45ml nước muối sinh lý, trộn đều trong 2-3 phút sau ta có được dung dịch mẫu thử ở đậm độ pha loãng 10-1.
Tiếp tục hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử ở nồng độ 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý khuấy đều trong vòng 2-3 phút ta thu được dung dịch mẫu thử ở đậm độ pha loãng 10-2. Tiếp tục làm tương tự như trên để có được những đậm độ pha loãng tiếp theo, pha loãng mẫu đến khi không còn khả năng dương tính, tùy theo từng loại mẫu sạch hay bẩn mà ta tiến hành pha loãng đến đậm độ thích hợp.
+ Nuôi cấy mẫu
Đối với một mẫu phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ nuôi trong 3 ống môi trường canh thang Tripton Lauryl sulfate, mỗi ống 1ml dung dịch mẫu thử
Sau đó lắc đều môi trường và đem nuôi trong tủ ấm 37°C từ 24-48 giờ.
Xác định ống dương tính ở từng đậm độ (ống dương tính làm đục môi trường và sinh hơi, sủi bọt khí).
+ Cấy chuyển
Từ những ống dương tính ở bước 1, dùng que cấy vô trùng cấy chuyển tương ứng canh trùng sang những ống canh thang EC, mỗi ống 1 ăng (tương ứng đậm độ mỗi mẫu thử).
Sau khi cấy xong ta lắc đều môi trường và đem nuôi cấy trong tủ ấm 42°C trong vòng 24-48 giờ.
Xác định số ống dương tính ở từng đậm độ (ống dương tính: Làm đục canh thang, sinh hơi môi trường chuyển sang màu vàng.
+ Cấy chuyển sang môi trường pepton để kiểm tra tính sinh Indol.
Các ống dương tính ở môi trường EC ta tiếp tục cấy chuyển sang môi trường pepton kiềm, dùng ăng cấy vô trùng để cấy chuyển tương ứng canh trùng sang những ống canh thang pepton kiềm, mỗi ống 1 ăng tương ứng với từng đậm độ, ủ trong tủ ấm 44°C trong vòng 24-48 giờ.
Từ những ống dương tính ở bước trên, thêm 0,5ml thuốc thử Kovacs vào mỗi ống, trộn kỹ và kiểm tra sau 1 phút. Nếu trong ống nghiệm xuất hiện 1 vòng nhẫn màu đỏ chứng tỏ có mặt Indol, nếu không có mặt Indol chỉ xuất hiện một vòng nhẫn màu vàng.
+ Tính kết quả
Đếm những ống dương tính với Indol ở mỗi nồng độ trong bước trên, và từ những ống dương tính trên ta tiến hành tra bảng MPN để xác định tổng số E. coli
Lấy mẫu, pha loãng mẫu: 1ml 1ml 90 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 10 g (ml) thực 10-1 10-2 10-3 Bước 1: Canh thang lactose Canh thang lactose Canh thang lactose Bước 2:
37°C/24-48h
Canh thang mật bò Canh thang mật bò Canh thang mật bò Bước 3:
44- 45,5°C/ 24–48h
Thạch Endo 37°C/24 giờ
Bước 4: Chọn khuẩn lạc nghi ngờ là E.coli, rồi tiến hành làm test IMViC Bước 5: Xác định tổng số E.coli dựa vào bảng số MPN.
Hình 3.2: Sơ đồ phương pháp xác định tổng số E.coli trong thực phẩm theo phương pháp MPN