CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Nghiên cứu phát sinh hình thái và biến đổi gen đậu tƣơng
1.3.2. Nghiên cứu phát sinh hình thái ở đậu tƣơng
tương Nghiên cứu phát sinh hình thái chồi và rễ
Nhiều nghiên cứu phát sinh chồi bất định ở đậu tƣơng đã đƣợc thực hiện trên các giống khác nhau. Các nghiên cứu cho thấy nhiều loại mẫu có thể đƣợc sử dụng để cảm ứng tạo chồi nhƣ đốt lá mầm, một nửa hạt, trụ trên và dƣới lá mầm… Trong đó mẫu mơ phân sinh ở vùng đốt lá mầm đƣợc ghi nhận có khả năng tạo chồi tốt nhất trên hầu hết các giống. Mức độ tạo chồi của mẫu phụ thuộc vào một số yếu tố nhƣ mơi trƣờng (khống), chất điều hịa sinh trƣởng, nồng độ chất điều hòa, giống đậu tƣơng... Để tạo chồi bất định, mẫu cần đƣợc cảm ứng bởi một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trƣởng, chủ yếu là cytokinin. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung khảo
sát hiệu quả của việc tạo chồi bằng cách sử dụng các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau, sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp, đồng thời thay đổi nồng độ chất điều hịa sinh trƣởng để tìm cách thức cảm ứng chồi tốt nhất. Hầu hết các loại cytokinin gồm BA, TDZ, kinetin, zeatin đều đã đƣợc sử dụng. Ngoài ra, các nghiên cứu tạo rễ cho chồi
in vitro để tạo cây con hoàn chỉnh cũng đã đƣợc thực hiện trên mơi trƣờng có hoặc
không bổ sung auxin. Sau đây là những nghiên cứu cụ thể.
Nghiên cứu tạo chồi in vitro đầu tiên ở đậu tƣơng đƣợc thực hiện bởi Cheng và cộng sự (1980), sử dụng BA (5 - 50 µM) để cảm ứng chồi từ đốt lá mầm (giống Amsoy và Dare, Mỹ). Nghiên cứu đã mô tả cách thu nhận mẫu đốt lá mầm cũng nhƣ chứng tỏ với sự cảm ứng của BA, mẫu đốt lá mầm có thể tạo nhiều chồi bất định [99]. Các nghiên cứu tạo chồi in vitro về sau hầu hết đều sử dụng mẫu đốt lá mầm thu nhận theo những mô tả này. Tác giả cũng ghi nhận khả năng hình thành rễ của chồi trên mơi trƣờng MS khơng bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng, các cây in vitro này sau đó có thể thích nghi và phát triển trong điều kiện vƣờn ƣơm.
Franklin và cộng sự (2004) nghiên cứu khả năng cảm ứng tạo chồi của BA và TDZ trên đốt lá mầm một số giống đậu tƣơng ở Mỹ (PNP, Dekalb, Sandusky, CNRR 279, CB 277). Trên giống PNP, kết quả cho thấy BA và TDZ khi đƣợc sử dụng riêng lẻ hay kết hợp đều có khả năng cảm ứng tạo chồi khá tốt, với nồng độ BA cố định 13,3 µM cho tỉ lệ mẫu tạo chồi 50%; 3,2 chồi/mẫu và nồng độ TDZ (4,45 – 22,71 µM) tối ƣu 4,54 µM cho hiệu quả tạo chồi 68%, 7,3 chồi/mẫu; sự kết hợp 4,54 µM TDZ + 13,3 µM BA dẫn đến tăng khả năng cảm ứng chồi so với sử dụng riêng lẻ từng chất (84%; 19,2 chồi/mẫu). Khi áp dụng môi trƣờng tối ƣu với các giống khác, tác giả nhận thấy có sự thay đổi về khả năng tái sinh tuy nhiên hiệu quả tái sinh vẫn khá cao (>69%) [100]. Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy khi bổ sung NAA vào môi trƣờng đã giúp tăng đáng kể khả năng tạo rễ của chồi in vitro,
với tỉ lệ chồi tạo rễ đạt cao nhất 88,3% ở nồng độ 2,69 µM so với đối chứng không bổ sung NAA là 12,5%.
Nghiên cứu của Janani và Kumari (2013) trên giống JS335 Ấn Độ cũng sử dụng TDZ và BA để cảm ứng tạo chồi từ đốt lá mầm, trong đó cả BA và TDZ đều đƣợc khảo sát các nồng độ khác nhau (5-25 µM) để tìm nồng độ tối ƣu. Kết quả ghi nhận cho thấy cả BA và TDZ đều có khả năng cảm ứng tạo chồi tốt, ở nồng độ tối
ƣu TDZ (15 µM) cảm ứng tạo chồi tốt hơn so với nồng độ BA tối ƣu (15 µM) (80%, 8,33 chồi/mẫu) so với (53,3%, 4,7 chồi/mẫu). Tăng nồng độ quá mức tối ƣu, cả TDZ và BA đều dẫn đến giảm khả năng cảm ứng chồi [101]. Nhƣ vậy, nghiên cứu trên các giống đậu tƣơng Ấn Độ và Mỹ đều cho thấy TDZ và BA có khả năng cảm ứng tạo chồi tốt trên mẫu đốt lá mầm trong đó TDZ có phần hiệu quả hơn, xét về tỉ lệ mẫu tạo chồi và số chồi/mẫu [100][101]. Ngồi ra có thể thấy, nồng độ tối ƣu của TDZ thay đổi khá lớn giữa giống của Mỹ và Ấn Độ, trong khi nồng độ tối ƣu giống PNP (Mỹ) chỉ 4,45 µM, giống JS335 (Ấn Độ) cần 15 µM. Đối với BA, nồng độ tối ƣu của giống Ấn Độ khá gần với nồng độ sử dụng với giống Mỹ (13,3 và 15 µM). Chồi tạo thành (giống JS335 Ấn Độ) đƣợc cảm ứng tạo rễ trên môi trƣờng MS bổ sung IBA ở các nồng độ khác nhau từ 5 đến 25 µM. Kết quả ghi nhận, trên mơi trƣờng bổ sung 20 µM IBA chồi có khả năng tạo rễ tốt nhất với 41,6 rễ/chồi, khi tăng lên 25 µM IBA làm giảm khả năng tạo rễ, còn 36,3 rễ/chồi.
Ma và Wu (2008) khảo sát khả năng tạo chồi từ đốt lá mầm nguyên (giữ nguyên hai lá mầm, không chẻ đôi) của một số giống đậu tƣơng Trung Quốc (Jilin 35, Dongnong 42, Hefeng 25, Hefeng 41) cho thấy 3 mg/l BA có khả năng cảm ứng tạo chồi cao với tỉ lệ mẫu tạo chồi trung bình 97,2%, 13 chồi/mẫu. Tỉ lệ mẫu tạo chồi khơng có nhiều khác biệt giữa các giống, tuy nhiên số chồi/mẫu thay đổi từ 7- 18. Ngoài ra, nghiên cứu ghi nhận sự kết hợp nồng độ tối ƣu BA 3 mg/l với hàm lƣợng nhỏ kinetin 0,5 mg/l và IBA 0,2 mg/l giúp tăng số chồi nhận đƣợc, tối ƣu ở giống Hengfeng 25 với 30 chồi/mẫu [102].
Zia và cộng sự (2010) nghiên cứu tái sinh chồi từ đốt lá mầm 2 giống đậu tƣơng NARC-4 và NARC-7 (Parkistan) sử dụng riêng lẻ từng chất BAP, Kinetin và Zeatin. Kết quả cho thấy cả ba chất đều có khả năng cảm ứng tạo đa chồi trong đó 1 mg/l BAP cảm ứng tạo chồi tốt nhất ở cả hai giống NARC-4 (88% mẫu tạo chồi; 7,3 chồi/mẫu) và NARC-7 (82% mẫu tạo chồi; 6,4 chồi/mẫu). Khi tăng nồng độ lên 2 mg/l khả năng cảm ứng tạo chồi của BAP, Kinetin và Zeatin đều giảm ở cả hai giống. Ngoài ra, IBA đƣợc ghi nhận giúp tăng đáng kể khả năng tạo rễ cho chồi in vitro với nồng độ tối ƣu là 1 mg/l cả giống NARC-4 (76,3% chồi tạo rễ; 4,7 rễ/chồi)
tạo rễ, tăng nồng độ IBA dẫn đến giảm khả năng tạo rễ ở cả tỉ lệ chồi tạo rễ và số rễ/chồi của hai giống [103].
Soto và cộng sự (2013) sử dụng BAP (0,5-6 mg/l) trên giống Incasoy-36 của Cuba, nhận thấy tỉ lệ tạo chồi tối ƣu với BAP 1,5 mg/l (96,8%, 4,3 chồi/mẫu). Tăng nồng độ BAP trên 1,5 mg/l làm giảm khả năng tạo chồi, đồng thời ở nồng độ quá cao 6 mg/l, ghi nhận hiện tƣợng tạo nhiều chồi nhỏ bất thƣờng. Nồng độ BAP từ 3 mg/l trở lên cũng dẫn đến tạo nhiều mô sẹo ở vùng trụ dƣới lá mầm, ảnh hƣởng xấu tới sự tạo và phát triển chồi [104]. Trên giống đậu tƣơng này, các tác giả ghi nhận chồi in vitro có khả năng tạo rễ tốt, với tỉ lệ chồi tạo rễ 97%, trên môi trƣờng MS khơng bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng.
Mangena và cộng sự (2015) nghiên cứu khả năng cảm ứng tạo chồi từ đốt lá mầm của BA và Kinetin trên giống giống LS 677, Nam Phi. Kết quả cho thấy 2 mg/l BA cho hiệu quả cảm ứng chồi tốt nhất với tỉ lệ mẫu tạo chồi 56,7%, 5,27 chồi/mẫu. Khi tăng nồng độ BA lên 4 mg/l dẫn đến giảm khả năng cảm ứng tạo chồi đồng thời kích thích tạo nhiều mơ sẹo. Các tác giả cũng ghi nhận sự kết hợp của BA ở nồng độ tối ƣu (2 mg/l) và 1 mg/l Kinetin làm giảm khả năng cảm ứng chồi với tỉ lệ mẫu tạo chồi giảm cịn 13,3%, 2 chồi/mẫu. Ngồi ra, nghiên cứu cũng cho thấy mẫu đốt lá mầm không bị tách đôi cho hiệu quả tạo chồi cao hơn so với mẫu đốt lá mầm thông thƣờng [105]. Với khảo sát tạo rễ, chồi in vitro đƣợc ghi nhận có khả năng hình thành rễ tốt trên mơi trƣờng MS khơng bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng, cây con tạo thành cũng có thể thích ứng, phát triển trong vƣờn ƣơm, với tỉ lệ cây sống khoảng 70%.
Raza và cộng sự (2017) sử dụng nhiều loại mẫu khác nhau gồm trụ hạ diệp, trụ hạ diệp tách đôi và đốt lá mầm của 9 giống đậu tƣơng (Australia) để cảm ứng tạo chồi với 1,67 mg/l BA. Kết quả cho thấy khả năng cảm ứng tạo chồi ở các giống khác nhau với tỉ lệ tạo chồi và số chồi/mẫu thay đổi: trụ hạ diệp (50 - 100%; 2,7 - 4,2 chồi/mẫu); trụ hạ diệp tách đôi (60 - 87%; 4,2 - 10 chồi/mẫu); đốt lá mầm (75 - 100%, 2,6 - 10,5 chồi/mẫu). Nhƣ vậy, mặc dù trụ hạ diệp cũng có thể tạo chồi khá tốt ở một số giống khi cảm ứng bởi BA, nhƣng nhìn chung đốt lá mầm vẫn có hiệu quả tốt hơn ở hầu hết giống [106]. Để tạo rễ cho chồi in vitro, các tác giả sử dụng
IBA ở nồng độ cố định 1 mg/l bổ sung vào môi trƣờng MS, kết quả ghi nhận cho thấy hầu hết chồi đều có khả năng tạo rễ tốt.
Các nghiên cứu trên cho thấy BA, một cách xuyên suốt có khả năng cảm ứng tạo chồi tốt trên nhiều giống đậu tƣơng. Nồng độ tối ƣu thay đổi khác nhau phụ thuộc vào giống (từ 1 đến 3 mg/l), khi vƣợt quá nồng độ tối ƣu, sẽ dẫn đến làm giảm khả năng cảm ứng chồi. Giữa các giống khác nhau khả năng cảm ứng chồi tối ƣu cũng thay đổi đáng kể, từ khoảng 55% (3 chồi/mẫu) - 100% (10 chồi/mẫu). Với khả năng tạo rễ của chồi in vitro, mặc dù ở một số giống, chồi có thể tạo rễ khơng cần bổ sung auxin ngoại sinh, tuy nhiên các nghiên cứu cho thấy, khi đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy, auxin (IBA hoặc NAA) đều giúp tăng đáng kể hiệu quả tạo rễ ở cả tỉ lệ mẫu tạo rễ và số rễ/chồi.
Các nghiên cứu tái sinh tạo chồi bất định từ đốt lá mầm của các giống đậu tƣơng trong nƣớc có kết quả khá giống với nghiên cứu nƣớc ngoài. Hầu hết các nghiên cứu đều dùng BA để cảm ứng tạo chồi, nồng độ BA tối ƣu đạt đƣợc cũng thay đổi từ 1-2 mg/l với khả năng cảm ứng chồi tối ƣu của các giống thay đổi từ khoảng 84% (2 chồi/mẫu) - 98% (5,5 chồi/mẫu). Chồi in vitro đƣợc cảm ứng tạo rễ trên môi trƣờng MS bổ sung IBA với nồng độ tối ƣu khoảng 1 mg/l trong các nghiên cứu khác nhau.
Cụ thể các nghiên cứu nhƣ sau:
Nghiên cứu tái sinh đậu tƣơng cũng đã đƣợc một số tác giả trong nƣớc thực hiện. Nguyễn Thị Thu Hƣờng và cộng sự (2009) nghiên cứu khả năng cảm ứng tạo chồi của BA trên đốt lá mầm 2 giống đậu tƣơng ĐT12 và ĐT84 cho thấy 1,5 mg/l BA có khả năng cảm ứng tạo chồi tốt nhất trên cả hai giống ĐT 12 (91,2% mẫu tạo chồi; 2,3 chồi/mẫu) và ĐT 84 (92,1% mẫu tạo chồi; 2,2 chồi/mẫu). Khi tăng nồng độ BA lên 1,67 mg/l đều dẫn đến giảm đáng kể hiệu quả cảm ứng chồi trên cả hai giống. Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy việc tạo vết thƣơng cho vùng đốt lá mầm là cần thiết để cảm ứng tạo đa chồi. Nghiên cứu cũng ghi nhận 1 mg/l IBA có khả năng cảm ứng tạo rễ tốt nhất cho chồi ở cả 2 giống ĐT 12 (98% chồi tạo rễ) và ĐT 84 (97% chồi tạo rễ). Tăng nồng độ IBA lên 1,5 và 2 mg/l đều làm giảm khả năng tạo rễ của chồi đáng kể [107].
Nguyễn Tiến Dũng và Ngơ Xn Bình (2011) nghiên cứu ảnh hƣởng của BA và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ đốt lá mầm của 10 giống đậu tƣơng Việt Nam đã nhận thấy BA có khả năng cảm ứng tạo đa chồi tốt hơn so với Kinetin. Nồng độ tối ƣu của BA thay đổi tùy giống và nằm trong khoảng 1 - 2 mg/l với tỉ lệ mẫu tạo chồi từ 84 - 98%, số chồi/ mẫu từ 2,1 - 3,57 [108].
Phan Lê Tƣ và cộng sự (2018) sử dụng 1 mg/l BA cảm ứng tạo đa chồi từ đốt lá mầm của 6 giống đậu tƣơng Việt Nam cho thấy sử dụng 1 mg/l có khả năng kích thích tạo đa chồi khá tốt trên hầu hết các giống với tỉ lệ mẫu tạo chồi từ 78,7 - 94,7%, số chồi/mẫu từ 2,86 - 5,49 [109]. Chồi in vitro trong nghiên cứu có thể tạo rễ tốt trong mơi trƣờng bổ sung IBA 1 mg/l.
Ngồi ra, nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens trên đậu tƣơng phần lớn đều sử dụng mẫu đốt lá mầm làm vật liệu chuyển gen với BA là chất cảm ứng tạo chồi. Nồng độ BA thay đổi tùy giống đậu tƣơng, thƣờng biến động trong khoảng 1 - 2 mg/l [110][111][112]. Để cảm ứng rễ chồi chuyển gen, hầu hết nghiên cứu sử dụng IBA với nồng độ khoảng 1 mg/l, trong môi trƣờng hoặc nhúng trƣớc khi chuyển vào môi trƣờng nuôi cấy.
Nhƣ vậy, nhiều nghiên cứu cảm ứng tạo chồi bất định từ đốt lá mầm trên các giống đậu tƣơng khác nhau trong và ngoài nƣớc đã cho thấy, trong các loại cytokinin đƣợc sử dụng khảo sát TDZ và BA có khả năng cảm ứng tạo chồi tốt nhất, khả năng này thể hiện trên hầu hết các giống khác nhau, tuy nồng độ tối ƣu thay đổi tùy giống. Các nghiên cứu của Franklin và cộng sự (2004), Janani và Kumari (2013) cho thấy TDZ có phần hiệu quả hơn so với BA trong việc cảm ứng tạo chồi, tuy nhiên các nghiên cứu này chƣa đánh giá mức độ đồng đều, khả năng phát triển của các chồi này thành cây hoàn chỉnh [100] [101]. Một số nghiên cứu cho thấy TDZ dễ tạo các dạng tái sinh bất thƣờng [113][114]. Hơn nữa, theo ghi nhận, hầu hết các nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens dùng mẫu đốt lá mầm, một nửa hạt tạo đƣợc cây đậu tƣơng chuyển gen hữu thụ đều sử dụng BA để cảm ứng chồi [110][111][112], điều này có thể do, BA vừa có khả năng cảm ứng chồi tốt trên hầu hết giống, các chồi này cũng có khả năng phát triển bình thƣờng và tạo cây chuyển gen hữu thụ.
Tóm lại, dựa trên các nghiên cứu cảm ứng chồi, tạo tạo rễ cho chồi in vitro của nhiều giống đậu tƣơng, cũng nhƣ các nghiên cứu chuyển gen vào đậu tƣơng, BA và IBA lần lƣợt đƣợc ghi nhận là loại cytokinin, auxin thích hợp để cảm ứng chồi, rễ trong giai đoạn nuôi cấy mô, ứng dụng cho nghiên cứu chuyển gen trên nhiều giống khác nhau, tuy nhiên vẫn cần khảo sát để tìm nồng độ thích hợp nhất giúp tạo cây con hồn chỉnh.
Nghiên cứu tạo phơi soma
Christianson và cộng sự (1983) lần đầu tiên mô tả sự tái sinh thơng qua tạo phơi soma của đậu tƣơng [115]. Sau đó, Lazzeri và cộng sự (1985) đã thành công khi sử dụng lá mầm chƣa trƣởng thành để cảm ứng tạo phôi soma [116]. Từ đó, hầu hết các nghiên cứu sau này đã sử dụng lá mầm chƣa trƣởng thành để tạo phôi soma [117][118]
Nhiều loại auxin đã đƣợc sử dụng để cảm ứng tạo phơi soma ở đậu tƣơng, trong đó 2,4-D cho thấy hiệu quả trong nhiều nghiên cứu [119]. Sự phát sinh phôi soma từ lá mầm chƣa trƣởng thành phụ thuộc nhiều vào giống [27][120].
1.3.3. Nghiên cứu biến đổi gen đậu tương
Hai phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất để chuyển gen vào đậu tƣơng là phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và phƣơng pháp bắn gen. Mỗi phƣơng pháp đều có những ƣu nhƣợc điểm riêng và đƣợc lựa chọn sử dụng tùy thuộc vào điều kiện trang thiết bị, giống, chủng vi khuẩn, thực vật…
1.3.3.1. Chuyển gen vào đậu tương sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens
Khả năng xâm nhiễm tự nhiên của vi khuẩn A. tumefaciens trên đậu tƣơng
thấp hơn nhiều so với các cây hai lá mầm khác nhƣ thuốc lá… Do đó, để biến nạp gen vào đậu tƣơng cần nhiều cải tiến để nâng cao hiệu quả chuyển gen. Mặc dù, nhiều nghiên cứu đã góp phần tăng khả năng chuyển gen, tuy nhiên đến nay đậu tƣơng vẫn đƣợc xem là một đối tƣợng khó chuyển gen, hiệu quả chuyển gen phụ thuộc nhiều vào giống và kỹ năng của ngƣời thực hiện. Nhiều loại mẫu khác nhau có thể đƣợc dùng để chuyển gen nhƣ đốt lá mầm, một nửa hạt, trụ hạ diệp, lá mầm non, đỉnh chồi… Trong đó, đốt lá mầm và một nửa hạt đƣợc sử dụng phổ biến nhất