CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.5. Hóa chất trong các thí nghiệm khác
-Tách chiết DNA từ thực vật
Phương pháp của Dellaporta và cộng sự (1983) [155].
+ NaCl 5 M. + SDS 10%.
+ β Mercaptoethanol. + Potassium acetate 5M.
+ Tris-HCl 1 M. + RNAse.
+ EDTA 0.5 M. + Ethanol 80%.
+ Isopropanol. + Phenol/Chloroform 1:1.
Bộ DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)
-Phản ứng PCR
Kit PCR của Promega gồm: dNTPs (ATP, CTP, GTP, TTP), dung dịch đệm PCR 10X, Taq Polymerase, nƣớc PCR
+ Mồi xuôi (Primer F) và mồi ngƣợc (Primer R). + Mẫu DNA thực vật.
-Hóa mơ GUS
+ Dung dịch stock X-gluc 0,02 M: 70 mg X-gluc, 2 ml DMSO, 8 ml nƣớc cất vô trùng.
+ Dung dịch X-gluc nhuộm mẫu: 5 ml stock X-gluc, 10 ml dung dịch đệm Na2HPO4 (pH 7), 4 ml EDTA 0,25 M (pH 7), 1 ml triton-X 100 10%.
- Điện di trên gel agarose
+ Agarose. + Gelred.
+ Dung dịch đệm TAE (10X stock): Tris base 48,4 g/l, glacial acetic acid 11,4 ml, EDTA Disodium 3,72 g/l pH 8 800 ml, nƣớc lên thể tích 1 lít.
- Thí nghiệm chuyển gen
+ Phosphinothricin (PPT): pha trong nƣớc cất, lọc vô trùng, nồng độ stock 2,5 mg/ml dùng để chọn lọc đối với gen bar.
+ Kanamycin: nồng độ stock 10 mg/ml, pha trong nƣớc cất, lọc vô trùng.Sử dụng chọn lọc vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid chuyển gen.
+ Rifamicin: stock 10 mg/ml, pha trong nƣớc cất và lọc vô trùng. Sử dụng cho chọn lọc vi khuẩn A. tumefaciens mang helper plamid.
+ Acetosyringone: 2 mg/ml hịa tan trong cồn, thêm nƣớc cất, lọc vơ trùng. + Cefotaxime: 500 mg/ml pha trong nƣớc cất, lọc vô trùng, dùng diệt khuẩn. - Southern bot
Bộ kit Amersham ECL Direct Nucleic Acid Labelling And Detection Systems của công ty GE Healthcare UK.
+ Depurination solution: HCl 250 mM.
+ Denaturation solution: NaCl 1,5 M ; NaOH 0,5 M. + Neutralizing solution: NaCl 1,5 M; Tris HCl 0,5 M. + 20x SSC: Na3citrate 0,3 M; NaCl 3 M.
+ Primary wash buffer: Urea 6 M; SDS 0,4%; 20 x SSC. + Secondary wash buffer: 20 x SSC.
- Thử nghiệm tính kháng thuốc diệt cỏ của cây chuyển gen
+ Thuốc diệt cỏ Basta: Có thành phần DL-Phosphinothricin (glufosinate ammonium) 200 g/l.