Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt.
3.1. Tuyển chọn các giống đậu tƣơng
Bảy giống đậu tƣơng đã đƣợc thu thập, trong đó các giống MTĐ 176; MTĐ 760-4; MTĐ 860-3; MTĐ 885-1; HL 07-15; OMĐN 29 là các giống lai đã đƣợc thuần hóa, giống Edamame là giống nhập từ Nhật có hạt to dùng để ăn trực tiếp hạt non.
Phân tích hàm lƣợng β-carotene trong hạt của các giống đậu tƣơng đã thu thập bằng phƣơng pháp HPLC cho thấy ở tất cả các giống đều có sự hiện diện của β-carotene, tuy nhiên với hàm lƣợng thấp, trong đó giống MTĐ 176 có hàm lƣợng 1,97 µg/g (bảng 3.1).
Nhiều nghiên cứu phân tích hàm lƣợng β-carotene trong các giống đậu tƣơng khác nhau cũng ghi nhận hàm lƣợng khá thấp của loại carotenoid này trong hạt đậu tƣơng, trong nghiên cứu của Panwar và cộng sự 2015, ghi nhận hàm lƣợng β- carotene của giống Pusa (Ấn Độ) bằng HPLC, chỉ đạt 0,02 µg/g; nghiên cứu của Schmidt và cộng sự (2015) trên giống Jack đạt 0,5 µg/g [160][161]. Gần đây, nghiên cứu của Gebregziabher và cộng sự (2021) khi phân tích hàm lƣợng β- carotene trên các giống đậu tƣơng Trung Quốc bằng HPLC đã ghi nhận hàm lƣợng lớn hơn nằm trong khoảng 3,25-6,61 µg/g [162]. Nhƣ vậy, mặc dù hàm lƣợng β- carotene có sự thay đổi giữa các giống đậu tƣơng khác nhau nhƣng nhìn chung sự tích lũy β-carotene trong hạt đậu tƣơng khá thấp. Tuy nhiên, do β-carotene là tiền chất để tổng hợp astaxanthin nên việc tăng cƣờng con đƣờng tổng hợp β-carotene là điều cần thiết trong chiến lƣợc thu nhận astaxanthin. Trong nghiên cứu này, gen mã hóa enzyme phytoene synthase sẽ đƣợc chuyển vào đậu tƣơng để tăng cƣờng sinh tổng hợp phytoene, là tiền chất có thể thúc đẩy chuỗi chuyển hóa nhằm tổng hợp β- carotene ở mức độ cao hơn.
Các giống trong bộ giống đậu thu thập đƣợc đều ghi nhận có sự hiện diện của β-carotene nên đủ điều kiện để thực hiện chuyển gen theo chiến lƣợc đã đề ra. Tuy nhiên để đảm bảo sự ổn định và hiệu quả trong q trình thí nghiệm, các hạt giống đƣợc kiểm tra tỉ lệ nảy mầm bằng cách gieo trên giấy thấm ƣớt đặt trong đĩa petri.
1 cm
a b c d
e f g
ảng 3.1. Kiểm tra thành phần β-carotene ở các giống đậu tƣơng.
Giống đậu tƣơng MTĐ176 MTĐ 760-4 MTĐ 860-3 MTĐ 885-1 Edamame HL 07-15 OMĐN 29 β-carotene 1,97 µg/g Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Kết quả ghi nhận tỉ lệ nảy mầm cho thấy 4 giống MTĐ 176, HL 07-15; OMĐN 29 và Edamame có tỉ lệ nảy mầm cao (96-97%), 3 giống MTĐ 760-4; MTĐ 860-3; MTĐ 885-1 có tỉ lệ nảy mầm thấp hơn (89-92%) (bảng 3.2). Ngoài ra, lá mầm của giống Edamame dễ bị nứt, vỡ nên khơng thích hợp dùng cho các thí nghiệm cấy mơ, chuyển gen (hình 3.1). Từ các kết quả này, hạt của 3 giống MTĐ 176, HL 07-15; OMĐN 29 đƣợc chọn để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo của đề tài. Trong đó giống MTĐ 176 đƣợc Trần Thị Cúc Hòa (2008) ghi nhận có khả năng chuyển gen cao [163].
ảng 3.2. Tỉ lệ nảy mầm ở các giống đậu tƣơng
Giống đậu tƣơng MTĐ 176 MTĐ 760-4 MTĐ 860-3 MTĐ 885-1 Edamame HL 07-15 OMĐN 29 Tỉ lệ nảy mầm (%) 96 90 89 92 96 97 96
Hình 3.1. Hạt đậu tƣơng nảy mầm sau 5 ngày
a, b, c, d, e, f tương ứng với hạt đậu tương các giống MTĐ 860, MTĐ 760-4, MTĐ 885-1, Edamame, HL 07-15, OMĐN 29, MTĐ 176
3.2. Hiệu quả của các phƣơng pháp khử trùng hạt đậu tƣơng
Phƣơng pháp xử lý hạt đậu tƣơng với khí clo hoặc dung dịch Javel 50% ở các khoảng thời gian khác nhau đã đƣợc khảo sát. Với các nghiệm thức khử trùng bằng dung dịch Javel 50%, kết quả cho thấy thời gian xử lý mẫu có ảnh hƣởng đến hiệu quả khử trùng và khả năng nảy mầm của hạt (bảng 3.3). Ở thời gian xử lý 30 phút, vẫn còn mẫu nhiễm. Khi tăng thời gian khử trùng lên 40 phút và 50 phút đã tạo đƣợc mẫu sạch 100%, tuy nhiên tỉ lệ mẫu nảy mầm giảm đáng kể ở cả hai giống HL 07-15 và OMĐN 29. Nghiệm thức tối ƣu khi khử trùng bằng dung dịch Javel 50% tƣơng ứng với thời gian xử lý 40 phút có tỉ lệ hạt nảy mầm giảm cịn 75% (HL07- 15) và 77,78% (OMĐN 29).
Các nghiệm thức khử trùng bằng khí clo trong 16 hoặc 24 giờ đều tạo mẫu sạch 100%. Với thời gian xử lý 16 giờ nhận đƣợc tỉ lệ nảy mầm cao nhất là 94,44% (HL 07-15) và 91,67% (OMĐN 29), khi tăng thời gian xử lý lên 24 giờ làm giảm rõ rệt tỉ lệ nảy mầm (hình 3.2). Ngồi ra, khử trùng bằng khí clo giúp hạt nảy mầm đồng đều, thời gian nảy mầm ngắn, sau 5-6 ngày cây mầm vƣơn dài, lá mầm tách vỏ và chuyển màu xanh. Khử trùng bằng dung dịch Javel 50% làm thời gian cây nảy mầm chậm hơn 1-2 ngày, cây nảy mầm không đều. Nhiều nghiên cứu trên các giống đậu tƣơng khác nhau cũng ghi nhận thời gian khử trùng bằng clo phù hợp là khoảng 16 giờ [111][125][164], có thể kéo dài đến 24 giờ [126][165]. Thời gian khử trùng tối ƣu có thể cịn phụ thuộc vào điều kiện của hạt (mức độ sạch ban đầu, điều kiện bảo quản hạt...), tuy nhiên để đảm bảo tỉ lệ hạt nảy mầm, sức sống cây mầm, thời gian hạt tiếp xúc khí clo khơng nên kéo dài. Kết quả ghi nhận ở thí nghiệm này cho thấy thời gian khử trùng hạt chỉ nên giới hạn ở khoảng 16 giờ. Khử trùng hạt là bƣớc chuẩn bị mẫu đầu tiên trong thí nghiệm chuyển gen, đóng vai trị quan trọng ảnh hƣởng đến sự ổn định và thành công của các bƣớc tiếp theo. Ở giai đoạn này, mẫu hạt phải đƣợc khử trùng hoàn toàn đồng thời khả năng nảy mầm, sức sống của hạt không bị ảnh hƣởng nhiều, từ đó đảm bảo đƣợc khả năng tái sinh, tạo chồi cao của mẫu ở thí nghiệm tái sinh. Các yếu tố này sẽ góp phần quyết định sự thành cơng của q trình tạo mẫu, cây chuyển gen.
Tóm lại, khử trùng bằng khí clo trong thời gian 16 giờ đƣợc chọn áp dụng cho các giống đậu tƣơng trong nghiên cứu nhằm tạo ra nguồn nguyên liệu sạch, có sức sống, khả năng nảy mầm tốt và đồng đều giúp cho các thí nghiệm có thể bố trí ổn định, độ đồng nhất cao và hiệu quả. Thí nghiệm sử dụng hai giống HL 07-15 và OMĐN 29, kết quả tối ƣu đƣợc áp dụng cho giống MTĐ 176.
Hình 3.2. Hạt đậu tƣơng (HL 07-15) nảy mầm 5 ngày sau khi khử trùng .a. khí clo 16 giờ, b. Khí clo 24 giờ, c. Dung dịch Javel 50% 30 phút, d. Dung dịch a. khí clo 16 giờ, b. Khí clo 24 giờ, c. Dung dịch Javel 50% 30 phút, d. Dung dịch Javel 50% 40 phút, e. Dung dịch Javel 50% 50 phút
ảng 3.3. Tỉ lệ hạt đậu tƣơng không nhiễm và nảy mầm khi khử trùng bằng dung
dịch Javel hoặc khí clo. Tác nhân khử
trùng, thời gian
Tỉ lệ hạt không nhiễm (%)
Tỉ lệ hạt không nhiễm nảy mầm (%)1 HL 07-15 OMĐN 29 HL 07-15 OMĐN 29 Khí clo, 16 giờ 100 100 94,44 a 91,67 a Khí clo, 24 giờ 100 100 52,78 c 66,67 bc Javel 50%, 30 p 97,22 94,44 83,33 b 86,11 a Javel 50%, 40 p 100 100 75,00 b 77,78 ab Javel 50%, 50 p 100 100 52,78 c 50,00 c
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 theo kiểm định thống kê LSD. Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x trước khi xử lý thống kê.
3.3. Ảnh hƣởng của BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt
Nghiên cứu khả năng cảm ứng tạo chồi bất định của BA ở các nồng độ khác nhau đƣợc thực hiện trên 3 giống MTĐ 176, HL 07-15, OMĐN 29 với 2 qui cách mẫu đốt lá mầm (QC1) và một nửa hạt (QC2).
Nhìn chung sự cảm ứng chồi của BA với hai loại mẫu của cả ba giống đậu tƣơng khảo sát khá giống nhau (bảng 3.4, 3.5, 3.6). Ở các nghiệm thức đối chứng không bổ sung BA, tất cả mẫu đều khơng tạo chồi, một số mẫu hình thành rễ. Trên mơi trƣờng bổ sung từ 0,5 đến 2 mg/l BA, khả năng tạo chồi của mẫu đốt lá mầm và một nửa hạt đều tăng dần theo nồng độ BA. Ở nồng độ 2 mg/l BA, cả 2 loại mẫu của ba giống đều có mức tạo chồi tối ƣu về tỉ lệ mẫu tạo chồi (trên 90%) và số chồi trung bình/mẫu, giống MTĐ 176 (QC1: 4,83; QC2: 5,13); HL 07-15 (QC1: 5,17; QC2: 5,30); OMĐN (QC1: 5,03; QC2:5,10), chồi hình thành đồng đều, ít mơ sẹo (hình 3.3, 3.5, 3.6, 3.7). Khi tăng nồng độ BA lên 2,5-3 mg/l, ở giống MTĐ 176 khả năng tạo chồi của mẫu giảm cả về tỉ lệ mẫu tạo chồi và số chồi trung bình/mẫu; giống HL 07-15 và OMĐN 29 tuy tỉ lệ mẫu tạo chồi không thay đổi nhiều nhƣng số chồi trung bình/mẫu giảm dần. Đồng thời, ở cả ba giống, hình thái chồi nhận đƣợc khơng đồng đều, nhiều mẫu có mơ sẹo trắng xốp hình thành (hình 3.4).
ảng 3.4. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa
hạt giống MTĐ 176 Nồng độ BA (mg/l)
Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%)1 Số chồi/mẫu2
QC1 QC2 QC1 QC2 0 0,00 e 0,00 e 0,00 f 0,00 f 0,5 33,33 d 36,67 d 0,6 ± 0,17 e 0,67 ± 0,15 e 1 40,00 d 43,33 d 1,07 ± 0,21 d 1,20 ± 0,26 d 1,5 63,33 c 73,33 c 2,20 ± 0,36 c 2,63 ± 0,35 c 2 93,33 a 96,67 a 4,83 ± 0,59 a 5,13 ± 0,57 a 2,5 90,00 a 86,67 b 4,03 ± 0,40 a 4,00 ± 0,36 b 3 76,67 b 73,33 c 2,90 ± 0,36 b 2,43 ± 0,32 c
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x; số liệu (2) được chuyển sang dạng log(x+1) trước khi xử lý thống kê.
5 mm b f e d c a
Hình 3.3. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống MTĐ 176
ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.
a, b, c, d, e, f, g: đốt lá mầm tái sinh trên mơi trường có 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l BA.
Hình 3.4. Sự đáp ứng của đốt lá mầm và một nửa hạt của
giống MTĐ 176 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.
a, b, c: đốt lá mầm trên mơi trường có BA 0; 2; 3 mg/l; d, e, f: một nửa hạt trên mơi trường có BA 0; 2; 3 mg/l.
Hình 3.5. Sự hình thành chồi của mẫu một nửa hạt
giống MTĐ 176 ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.
a, b, c, d, e, f, g: đốt lá mầm tái sinh trên mơi trường có 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l BA. ảng 3 5. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một
nửa hạt giống HL 07-15 Nồng độ BA (mg/l)
Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%)1 Số chồi/mẫu2
QC1 QC2 QC1 QC2 0 0,00 e 0,00 e 0,00 e 0,00 e 0,5 36,67 d 40,00 d 0,70 ± 0,17 d 0,77 ± 0,15 d 1 53,33 c 56,67 c 1,57 ± 0,21 c 1,67 ± 0,25 c 1,5 76,67 b 73,33 b 2,73 ± 0,35 b 2,77 ± 0,31 b 2 96,67 a 96,67 a 5,17 ± 0,55 a 5,30 ± 0,56 a 2,5 96,67 a 93,33 a 4,87 ± 0,47 a 4,80 ± 0,53 a 3 93,33 a 96,67 a 4,50 ± 0,46 a 4,77 ± 0,65 a
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x; số liệu (2) được chuyển sang dạng log(x+1) trước khi xử lý thống kê.
Hình 3.6. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống HL 07-15
ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.
a, b, c, d, e, f, g: đốt lá mầm tái sinh trên mơi trường có 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l BA. ảng 3.6. Ảnh hƣởng của các nồng độ BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một
nửa hạt giống OMĐN 29 Nồng độ BA
(mg/l)
Tỉ lệ mẫu tạo chồi
(%)1 Số chồi/mẫu2 QC1 QC2 QC1 QC2 0 0,00 e 0,00 e 0,00 e 0,00 e 0,5 36,67 d 40,00 d 0,57 ± 0,15 d 0,67 ± 0,12 d 1 53,33 c 63,33 c 1,43 ± 0,25 c 1,67 ± 0,25 c 1,5 76,67 b 76,67 b 2,87 ± 0,40 b 2,93 ± 0,35 b 2 96,67 a 96,67 a 5,03 ± 0,51 a 5,10 ± 0,56 a 2,5 96,67 a 93,33 a 4,63 ± 0,45 a 4,80 ± 0,44 a 3 93,33 a 96,67 a 4,27 ± 0,55 a 4,70 ± 0,53 a
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x; số liệu (2) được chuyển sang dạng log(x+1) trước khi xử lý thống kê.
Hình 3.7. Sự hình thành chồi của đốt lá mầm giống OMĐN 29
ở các nồng độ BA khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy.
a, b, c, d, e, f, g: đốt lá mầm tái sinh trên mơi trường có 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l BA.
Nhƣ vậy, cả mẫu đốt lá mầm và nửa hạt trên 3 giống đều có khả năng đáp ứng tái sinh tốt với sự kích thích tạo chồi bất định của BA. Nồng độ BA tối ƣu với cả 3 giống trên đốt lá mầm và nửa hạt là 2 mg/l. Khả năng đáp ứng tái sinh của hai loại mẫu, một nửa hạt và đốt lá mầm, trên cả 3 giống khá giống nhau. Điều này có thể do bản chất của vùng tái sinh trên đốt lá mầm và một nửa hạt giống nhau, đều là vùng mô phân sinh bên (nách). Sự khác nhau về cách xử lý mẫu, thời gian nuôi mẫu (đốt lá mầm từ cây nảy mầm 5 ngày, một nửa hạt từ hạt ngâm trong nƣớc 20 giờ) không ảnh hƣởng nhiều đến khả năng tái sinh của vùng này.
Nhiều nghiên cứu trên các giống đậu tƣơng khác nhau cũng ghi nhận nồng độ BA tối ƣu cảm ứng tạo chồi từ đốt lá mầm khoảng 2 mg/l [111][127][129]. Khi
sử dụng nồng độ BA tối ƣu, khả năng tạo đa chồi đƣợc ghi nhận khác nhau giữa các giống, nhƣ giống Incasoy-36 (Cuba) có 96,8% mẫu tạo chồi với 4,3 chồi/mẫu [104], giống JS335 (Ấn Độ) có 53,33% mẫu tạo chồi, với 4,66 chồi/mẫu [101], một số giống Trung Quốc có 97,2% mẫu tạo chồi với 13 chồi/mẫu [102]. Hiện tƣợng khi tăng nồng độ quá mức tối ƣu, ảnh hƣởng không tốt đến khả năng tạo chồi cũng đƣợc nhiều tác giả ghi nhận nhƣ Janani và Kumari (2013) khi tăng nồng độ BA từ 15 µM lên 20 µM và 25 µM tỉ lệ tạo chồi và số chồi/mẫu đều giảm từ 53,3% xuống 50% và 43,3% [101]. Soto và cộng sự (2013) cho biết khi tăng nồng độ BA tối ƣu từ 1,5 mg/l lên 2; 3; 6 mg/l, tỉ lệ mẫu tạo chồi và số chồi/mẫu đều giảm [104]. Hiện tƣợng tạo mô sẹo nhiều ở vùng trụ dƣới lá mầm khi sử dụng nồng độ BA cao cũng đƣợc ghi nhận bởi Ma và Wu (2008) [102]. Trên một số giống cây khác dùng BA để cảm ứng tạo chồi trực tiếp từ mô phân sinh cũng ghi nhận các kết quả tƣơng tự, khi dùng BA ở nồng độ thích hợp sẽ kích thích tạo chồi, khi tăng cao dẫn đến tạo nhiều mô sẹo nhƣ trên cumin (thì là) ở 0,2 mg/l kích thích tạo và nhân chồi, cịn 0,9 mg/l kích thích tạo mơ sẹo [166]. Trên giống cam chua (Citrus aurantium) tái sinh chồi dùng BA cũng ghi nhận khi dùng BA 1 mg/l cảm ứng tạo chồi tốt nhất với 6,7 chồi/mẫu, khi tăng BA lên 2 và 3 mg/l dẫn đến khả năng cảm ứng chồi giảm cịn 2,3 và 1,6 chồi/mẫu [167]. Tóm lại, trên cả 3 giống và 2 qui cách mẫu, sử dụng BA ở nồng độ 2 mg/l cho kết quả tái sinh chồi tốt nhất. Do đó nồng độ này sẽ đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm chuyển gen ở giai đoạn nuôi chung và tái sinh chọn lọc chồi chuyển gen.
3.4. Ảnh hƣởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro
Các cụm chồi hình thành trên mơi trƣờng tái sinh bổ sung 2 mg/l BA đƣợc