L: thang chuẩn 1kb (Promega); PC: đối chứng dương; NC: cây đối chứng; E1, E2, E3, E4 là các dòng chuyển gen giả định
Kết quả phân tích PCR sử dụng các cặp mồi chuyên biệt cho gen bar, hbfd1 đã giúp khẳng định các dòng kháng PPT chọn lọc đƣợc đều mang gen biến nạp, đây khơng phải là các dịng khơng chuyển gen vƣợt qua đƣợc bƣớc chọn lọc với PPT. Điều này cho thấy phƣơng pháp chọn lọc thể chuyển gen đƣợc áp dụng có hiệu quả, giúp loại bỏ mơ, chồi khơng chuyển gen, chỉ những dịng chuyển gen có khả năng phát triển. Nhiều nghiên cứu cũng ghi nhận PPT giúp chọn lọc hiệu quả thể chuyển gen trên các giống đậu tƣơng khác nhau [112][124][125][126]. Tuy nhiên, việc ghi nhận có sự hiện diện của gen biến nạp chỉ là kết quả bƣớc đầu, chƣa thể kết luận hiệu quả của phƣơng pháp chuyển gen mà cần thêm những phân tích nhƣ Southern blot, định tính, định lƣợng chất mục tiêu.
LPCE1 E2E3E4NC Phân tích Southern blot gen cbfd2
Thơng qua phân tích bằng PCR đã xác định đƣợc các cây đậu tƣơng chuyển gen. Tuy nhiên để kiểm tra sự hòa nhập bền vững của các gen này vào bộ gen của cây, đồng thời xác định dòng chuyển gen riêng biệt, phân tích Southern blot, dựa trên lai phân tử với mẫu dị là đoạn trình tự của gen cbfd2 có kích thƣớc 500 bp đã đƣợc hiện. DNA tổng số của các dòng chuyển gen, đối chứng âm (cây không chuyển gen), đƣợc cắt bởi enzyme HindIII, đối chứng dƣơng (plasmid pITB-AST) đƣợc cắt bởi enzyme HindIII và EcoRI.
Kết quả trên hình 3.20 cho thấy ở đối chứng dƣơng có hiện băng lai, đối chứng âm không hiện băng lai. Ở vị trí các dịng chuyển gen đều hiện diện băng lai với các kích thƣớc khác nhau. Điều này chứng tỏ gen biến nạp đã đƣợc gắn chèn vào bộ gen cây ở những vị trí khác nhau, do đó các dịng này là các dịng chuyển gen riêng biệt.
bp
23130
9416
6557
4361
Hình 3.20. Kết quả phân tích DNA cây đậu tƣơng chuyển gen bằng Southern blot L. Thang chuẩn λ HindIII; PC. đoạn DNA 13,8 kb được cắt từ plasmid pITB-AST bởi hai hai enzyme HindIII và EcoRI; NC Cây đậu tương không chuyển gen; E1, E2, E3, E4 Các dòng cây đậu tương chuyển gen.
Kết quả kiểm tra gen biến nạp trên các cây kháng PPT bằng phƣơng pháp PCR và Southern blot đều dƣơng tính, chứng tỏ đây là các dòng chuyển gen, riêng biệt. Hiệu quả chuyển gen khi sử dụng kim châm tạo vết thƣơng là 1% (3 dòng chuyển gen/300 mẫu), dùng dao mổ là 0,33% (1 dịng chuyển gen/300 mẫu).
Nghiên cứu q trình xâm nhiễm, gây bệnh của vi khuẩn A. tumefaciens trên thực vật đã cho thấy, sự tạo vết thƣơng trên vật chủ là điều kiện cần thiết để vi khuẩn có thể xâm nhiễm và gây bệnh [169]. Những phân tử từ vết thƣơng của thực
vật giúp cảm ứng hoạt động của các gen vir trên vi khuẩn, kích hoạt sự chuyển gen diễn ra [170]. Ngoài ra, những tế bào ở trạng thái phân chia, nhân lên do cảm ứng từ việc bị tổn thƣơng cũng đƣợc ghi nhận có khả năng biến nạp gen cao thơng qua vi khuẩn A. tumefaciens [171]. Trên đậu tƣơng, một số cách tạo vết thƣơng khác nhau bằng cơ học hoặc sóng siêu âm, thấm hút chân khơng đã đƣợc sử dụng giúp vi khuẩn xâm nhiễm, chuyển gen hiệu quả [131][132][179]. Trong khảo sát này, kim châm, dao mổ đƣợc sử dụng để tạo vết thƣơng, kết quả ghi nhận đƣợc tần số chuyển gen khi dùng kim châm cao hơn dao mổ. Điều này có thể do đặc điểm vết thƣơng tạo ra bởi các dụng cụ này khác nhau. Vùng đốt lá mầm đậu tƣơng rất nhạy cảm, khi gây nhiều tổn thƣơng sẽ dễ bị hóa nâu, chết làm ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen [110][127]. Dùng dao mổ tạo vết thƣơng bằng cách cắt nhẹ, chính xác, 7-10 lần, khi thực hiện trên nhiều mẫu dễ dẫn đến sai sót gây tổn thƣơng mẫu quá mức. Dùng kim châm, châm nhẹ 3 lần, có thao tác đơn giản, tốn ít thời gian hơn, do đó ít sai sót mà vẫn tạo đƣợc các vết thƣơng đồng đều, không gây tổn thƣơng mẫu quá nhiều. Hiệu quả chuyển gen bằng phƣơng pháp dùng kim châm tuy có tăng so với dùng dao mổ nhƣng vẫn thấp hơn so với nhiều nghiên cứu khác trên thế giới nhƣ Liu và cộng sự (2014), 1,06%; Zhang và cộng sự (1999), 3%; Song và cộng sự (2013), 4,59% [112][164][177]. Điều này một phần có thể do khả năng biến nạp gen của các giống đậu tƣơng khơng giống nhau.
Các dịng đậu tƣơng chuyển gen khi tiếp tục phát triển trong vƣờn ƣơm khơng thể đậu trái mà nhanh chóng bị già, lá vàng, rụng, thân xuất hiện những đốm đen, cây chết dần. Do đậu tƣơng khó ni cấy mô, việc tái sinh không thực hiện đƣợc trên các bộ phận cây in vitro nhƣ đốt thân, lá… ngay cả nhân cây bằng đốt thân cũng khơng thể trẻ hóa đƣợc cây con, nên khơng thể thuần hóa cây thơng qua các đợt nuôi cấy chọn lọc các chồi, mô chuyển gen giả định ban đầu. Điều này dẫn đến một số cây chuyển gen có thể phát triển khơng ổn định và khảm sau khi trồng ra điều kiện ex vitro, các cây chuyển gen qua chọn lọc có biểu hiện tốt cũng khơng thể giữ giống hoặc nhân giống trong điều kiện in vitro. Mặc dù các dòng đậu tƣơng chuyển gen đã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp PCR và Southern blot. Tuy nhiên do cây không thể sinh sản, tạo hạt có astaxanthin nên chƣa thể xác định các gen biến nạp có biểu hiện để tạo đƣợc chất mục tiêu astaxanthin. Hiệu quả của cấu trúc
gen biến nạp do đó chƣa đƣợc chứng minh. Điều này chỉ có thể đƣợc xác định thông qua sự hiện diện và hàm lƣợng chất mục tiêu astaxanthin trong hạt đậu chuyển gen nhƣ đã đặt ra trong mục tiêu nghiên cứu.
3.11.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng dao mổ kết hợp sóng siêu âm, thấm chân không tạo vết thương mẫu
3.11.2.1. Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương
Các khảo sát trên đã tối ƣu phƣơng pháp sử dụng sóng siêu âm, thấm hút chân không để xử lý, tạo vết thƣơng mẫu giúp nâng cao hiệu quả chuyển gen gus vào đốt lá mầm đậu tƣơng. Các thông số này đƣợc áp dụng trong nghiên cứu chuyển gen tạo cây đậu tƣơng có khả năng tổng hợp astaxanthin chuyên biệt ở hạt. Ngoài ra, bên cạnh đốt lá mầm, mẫu một nửa hạt cũng đƣợc sử dụng làm vật liệu chuyển gen nhằm so sánh hiệu quả tiếp nhận gen so với mẫu đốt lá mầm.
Chọn lọc, tái sinh, tạo cây kháng PPT
Nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng mẫu đốt lá mầm và một nửa hạt, trong đó có sự hỗ trợ của sóng siêu âm, thấm chân khơng đã tạo đƣợc một số dịng kháng PPT. Cụ thể q trình từ sau khi đồng nuôi cấy đến khi chuyển cây ra vƣờn ƣơm nhƣ sau: Sau khi đồng nuôi cấy 5 ngày, hầu hết đốt lá mầm và một nửa hạt vẫn giữ đƣợc trạng thái tốt: mô chắc, không bị nhiễm quá nhiều khuẩn. Mẫu sau đó đƣợc rửa và thấm ráo để loại bớt vi khuẩn và cấy lên môi trƣờng tái sinh chọn lọc SI 6 mg/l PPT. Sau 2 tuần đầu, chất chọn lọc đã gây chết, ức chế tái sinh ở vùng mô phân sinh của nhiều mẫu, chuyển sang màu nâu đen, trong khi đó một số mẫu bắt đầu hình thành các cụm chồi nhỏ. Cấy chuyền mẫu sang môi trƣờng SI mới, một số cụm chồi phát triển, tuy nhiên ở cuối giai đoạn tái sinh chọn lọc, nhiều cụm chồi không vƣơn cao, lá vàng, đen, cả cụm chồi chết dần. Hiện tƣợng cụm chồi có thể hình thành, rồi chết dần trên mơi trƣờng chọn lọc có thể do những mơ lân cận trên lá mầm đã đƣợc biến nạp gen, đã chuyển hóa PPT ở vùng mơ phân sinh tiếp xúc giúp các mơ hình thành đƣợc chồi và sinh trƣởng đƣợc trong giai đoạn đầu khi cụm chồi chƣa phát triển lớn và chƣa bị tách rời. Ngoài ra, các hợp chất thiol trong môi trƣờng đồng nuôi cấy cũng đƣợc ghi nhận tạo tính kháng lại chất chọn lọc PPT nên gia tăng khả năng tạo chồi cho mẫu không chuyển gen dƣới tác động của PPT [180]. Sau 4 tuần trên môi trƣờng chọn lọc SI, chỉ một số ít
cụm chồi phát triển, đƣợc tách rời khỏi lá mầm và cấy chuyền sang môi trƣờng tăng trƣởng thân SE bổ sung 4 mg/l PPT.
Đối với hai giống HL 07-15, OMĐN 29, tất cả cụm chồi còn sót lại trên mơi trƣờng SI đều chết dần và khơng nhận đƣợc cây chuyển gen.
Đối với giống MTĐ 176, hầu hết các cụm chồi cũng chết dần, chỉ một số ít tiếp tục phát triển. Các chồi này khi cao khoảng 3 cm đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng tạo rễ RM bổ sung 1 mg/l PPT. Sau khoảng 3 - 4 tuần bộ rễ hình thành, cây đƣợc chuyển ra trồng ngồi vƣờn ƣơm (hình 3.21). Tần số tạo dịng kháng PPT đƣợc ghi nhận ở phƣơng pháp dùng dao mổ tạo vết thƣơng trên đốt lá mầm là 1/150 (0,67%), kí hiệu dịng là D1; phƣơng pháp tạo vết thƣơng kết hợp sóng siêu âm 30s là 3/150 (2%), kí hiệu dịng là D2, D3, D4; phƣơng pháp tạo vết thƣơng kết hợp thấm chân khơng 60s là 3/150 (2%), kí hiệu dịng là D5, D6, D7; và ở phƣơng pháp dùng mẫu một nửa hạt là 2/200 (1%), kí hiệu dòng là D8, D9.
Các kết quả trên cho thấy sự kết hợp sóng siêu âm hoặc thấm chân khơng trong quá trình tạo vết thƣơng cho mẫu đốt lá mầm đã giúp tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen. Điều này phù hợp với kết quả khảo sát chuyển gen gus cũng nhƣ nhiều nghiên cứu chuyển gen khác thông qua vi khuẩn A. tumefaciens [131][133][134] [173][176]. Ngoài ra, chuyển gen vào mẫu một nửa hạt cũng đạt đƣợc tần số khá cao, cho thấy khả năng áp dụng của loại mẫu này để chuyển gen vào đậu tƣơng. Mặc dù hai giống đậu tƣơng HL 07-15, OMĐN 29 có khả năng tái sinh tốt và có hình thành một số chồi kháng PPT trong các giai đoạn chọn lọc đầu, nhƣng cuối cùng không nhận đƣợc cây chuyển gen. Giống MTĐ 176 đáp ứng chuyển gen tốt hơn, tất cả các phƣơng pháp đều nhận đƣợc cây chuyển gen.
Các cây đậu tƣơng kháng PPT phát triển khá tốt in vitro. Các cây này sau khi kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển bằng PCR đều cho kết quả dƣơng tính. Tuy nhiên, khi chuyển ra trồng ex vitro, trong số 9 cây chuyển gen, chỉ 5 cây D2, D3, D5, D8, D9 có khả năng thích nghi, phát triển, 4 cây khơng thể thích nghi và chết dần.
1 cm
a 1 cm b 2 mm c
5 mm
d 1 cm e
Hình 3.21. Các bƣớc chuyển gen và tạo cây đậu tƣơng chuyển gen.
a:cây nảy mầm sau 7 ngày; b: mẫu đốt lá mầm đồng nuôi cấy với vi khuẩn; c: chồi hình thành sau 4 tuần trên mơi trường SI bổ sung 6 mg/l PPT; d,e: chồi kéo dài trên môi trường SE bổ sung 4 mg/l PPT và tạo rễ trên môi trường RM.
3.11.2.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen biến nạp trên các dòng kháng PPT bằng phương pháp PCR
DNA đƣợc ly trích từ lá của các dịng kháng PPT đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng PCR nhằm kiểm tra sự hiện diện của các gen biến nạp trong bộ gen cây, DNA của cây không chuyển gen sử dụng làm đối chứng âm (N), plasmid pITB- AST đƣợc dùng làm đối chứng dƣơng (P).
Kiểm tra sự hiện diện của gen bar
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen
bar, kích thƣớc đặc trƣng là 500 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 3.22)
nhƣ sau:
Hình 3.22. Kiểm tra sự hiện diện của
gen bar ở các cây kháng PPT bằng PCR.
L: thang chuẩn 1kb (Promega); P: đối chứng dương; N: cây đối chứng; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tương ứng các dòng chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9
Ở mẫu đối chứng dƣơng P (plasmid pITB-AST) và các cây chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9 đều có sự hiện diện của 1 băng DNA với kích thƣớc khoảng 500 bp khi so sánh với thang chuẩn (phù hợp với kích thƣớc đặc hiệu của đoạn DNA đƣợc khuếch đại là 500 bp), trong khi phản ứng PCR với mẫu đối chứng âm N (DNA của cây khơng chuyển gen) cho kết quả âm tính. Do đó, có thể khẳng định có sự hiện diện của gen bar trong tất cả các dòng kháng PPT. Sự biểu hiện của gen bar giúp các dịng này có thể tồn tại và phát triển trên mơi trƣờng có chất chọn lọc PPT.
Kiểm tra sự hiện diện của gen cbfd2
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen
cbfd2, kích thƣớc đặc trƣng là 500 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 3.23)
nhƣ sau:
Ở mẫu đối chứng dƣơng P (plasmid pITB-AST) và các cây chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9 đều có sự hiện diện của 1 băng DNA với kích thƣớc khoảng 500 bp khi so sánh với thang chuẩn (phù hợp với kích thƣớc đặc hiệu của đoạn DNA đƣợc khuếch đại là 500 bp), trong khi phản ứng PCR với mẫu đối chứng âm N (DNA của cây khơng chuyển gen) cho kết quả âm tính. Do đó, có thể khẳng định có sự hiện diện của gen cbfd2 trong tất cả các cây D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9.
Hình 3.23. Kiểm tra sự hiện diện của
gen cbfd2 ở các cây kháng PPT bằng PCR.
L: thang chuẩn 1kb (Promega); P: đối chứng dương; N: cây đối chứng; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tương ứng các dòng chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9
Kiểm tra sự hiện diện của gen hbfd1
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen
hbfd1, kích thƣớc đặc trƣng là 400 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 3.24)
Hình 3.24. Kiểm tra sự hiện diện của gen hbfd1 ở các cây kháng PPT bằng PCR. L: thang chuẩn 1kb (Promega); P: đối chứng dương; N: cây đối chứng; 1, 2, 3, 4, L: thang chuẩn 1kb (Promega); P: đối chứng dương; N: cây đối chứng; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tương ứng các dòng chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9
Ở mẫu đối chứng dƣơng P (plasmid pITB-AST) và các cây chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9 đều có sự hiện diện của 1 băng DNA với kích thƣớc khoảng 400 bp khi so sánh với thang chuẩn (phù hợp với kích thƣớc đặc hiệu của đoạn DNA đƣợc khuếch đại là 400 bp), trong khi phản ứng PCR với mẫu đối chứng âm N (DNA của cây không chuyển gen) cho kết quả âm tính. Do đó, có thể khẳng định có sự hiện diện của gen hbfd1 trong tất cả các cây D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9.
Kiểm tra sự hiện diện của gen Zm-psy
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen
Zm-psy, kích thƣớc đặc trƣng là 446 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 3.25)
nhƣ sau:
Hình 3.25. Kiểm tra sự hiện diện
của gen Zm-psy ở các cây kháng PPT bằng PCR.
L: thang chuẩn 1kb (Promega); P: đối chứng dương; N: cây đối chứng; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tương ứng các dòng chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9
Ở mẫu đối chứng dƣơng P (plasmid pITB-AST) và các cây chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9 đều có sự hiện diện của 1 băng DNA với kích thƣớc khoảng 446 bp khi so sánh với thang chuẩn (phù hợp với kích thƣớc đặc hiệu của đoạn DNA đƣợc khuếch đại là 446 bp), trong khi phản ứng PCR với mẫu đối chứng âm N (DNA của cây không chuyển gen) cho kết quả âm tính. Do đó, có thể khẳng định có sự hiện diện của gen Zm-psy trong tất cả các cây D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9.
Nhƣ vậy, kết quả PCR sử dụng các cặp mồi chuyên biệt cho gen bar, hbfd1,
cbfd2, Zm-psy đã giúp khẳng định các dòng kháng PPT chọn lọc đƣợc đều mang gen