a: lá cây đối chứng; b: lá cây chuyển gen
3.11.2.5. Kiểm tra sự di truyền của gen biến nạp
Trong 9 dòng đậu tƣơng chuyển gen đƣợc kiểm tra bằng PCR trồng trong vƣờn ƣơm, chỉ 5 dịng có khả năng thích nghi, phát triển. Các dịng này cũng biểu hiện tính kháng với thuốc diệt cỏ Basta (100 mg/l glufosinate) và có sự hiện hiện các băng lai đặc hiệu trong thí nghiệm Southern blot với probe là đoạn gen cbfd2.
Trong các dòng này, chỉ 2 dịng (D2, D8) có sự tạo hoa, trái, hình thành hạt (hình 3.28), 3 dịng cịn lại (D3, D5, D9) không tạo trái, mà sau một thời gian phát triển lá vàng, rụng, cây chết dần. Một số nghiên cứu chuyển gen trên đậu tƣơng cũng ghi nhận nhiều cây chuyển gen khi trồng trong vƣờn ƣơm không thể tạo hạt [130] [181]. Nguyên nhân có thể do rễ những dòng chuyển gen này kém phát triển ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển chung, ngồi ra vị trí gắn chèn của gen biến nạp cũng có thể gây ảnh hƣởng đến khả năng sống của giao tử [181][182].
Sau khoảng 4 tháng phát triển trong vƣờn ƣơm, trái của 2 dòng D2 và D8 đến giai đoạn chín, vỏ trái khơ, màu vàng. Dịng D2 thu đƣợc hai trái, mỗi trái 1 hạt, gồm 1 hạt màu đỏ (D2-1) và 1 hạt màu trắng (D2-2). Dòng D8 thu đƣợc 1 trái hai hạt, gồm 1 hạt đỏ (D8-1) và 1 hạt trắng (D8-2). Màu đỏ của các hạt thể hiện đậm và rõ ở phần rễ mầm, nhạt hơn ở phần phơi nhũ (hình 3.29). Nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin trên nhiều cây khác nhau cho thấy sự tích lũy astaxanthin trên các bộ phận của cây chuyển gen dẫn đến màu của các bộ phận này chuyển sang đỏ nhƣ ở thuốc lá, táo, ngô, cà chua,… [7][31][60][62].
Bốn hạt của hai dòng D2 và D8 đƣợc gieo trồng trong vƣờn ƣơm để kiểm tra khả năng nảy mầm, sinh trƣởng, phát triển của cây so với đối chứng. Trƣớc tiên, các hạt chuyển gen và đối chứng đƣợc gieo nảy mầm trong đĩa petri có giấy thấm nƣớc, ủ trong tối 4 ngày đến khi phần rễ mầm phát triển tốt. Sau đó, cây mầm đƣợc trồng trong chậu đất ở vƣờn ƣơm.
0,5 cm
Hình 3.28. Dịng chuyển gen D2 (a) và D8 (b) phát triển ngồi vƣờn ƣơm
Hình 3.29. Hạt màu đỏ của dòng D2 và D8
1, 2, 3: Hạt đậu tương màu trắng của cây đối chứng, dòng D2 và D8; 4, 5: Hạt đậu màu đỏ của dòng D2 và D8
Các chậu cây đƣợc trồng cách nhau khoảng 1 m để đảm bảo khoảng cách, ngăn sự lai chéo. Ngoài ra đậu tƣơng là cây tự thụ phấn, đặc biệt trong điều kiện nhà kín, khơng có cơn trùng, do đó giữa các cây đƣợc đảm bảo khơng có sự thụ phấn chéo [96][183].
Kiểm tra các gen biến nạp trong cây bằng PCR
Sau khoảng 1 tháng, các cây phát triển khá tốt, vƣơn dài, mọc nhiều nhánh bên. Nhìn chung khơng có sự khác biệt đáng kể giữa cây chuyển gen và đối chứng (hình 3.30). DNA của các dịng D2-1, D2-2, D8-1, D8-2 và đối chứng đƣợc ly trích, kiểm tra sự hiện diện của các gen biến nạp bằng PCR.
Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các gen biến nạp sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đƣợc thể hiện trên hình 3.31 cho thấy có sự hiện diện của tất cả các băng đặc hiệu của các gen bar, cbfd2, hbfd1 và Zm-psy ở dòng D2-1 và D8-1, là các dòng phát triển từ hạt đỏ. Ngƣợc lại, ở dòng D2-2, D8-2 (dòng phát triển từ hạt trắng) và đối chứng đều khơng có sự hiện diện của các băng đặc hiệu, do đó khơng có sự hiện diện của gen biến nạp. Các kết quả PCR chứng tỏ hai dòng D2-1 và D8-1 nhận đƣợc sự di truyền các gen biến nạp từ cây bố mẹ, trong khi dịng D2-2 và D8- 2 khơng nhận đƣợc sự di truyền.
Hình 3.30. Các giai đoạn phát triển của cây chuyển gen trồng từ hạt
a. Hạt nảy mầm sau 4 ngày; b. cây mầm phát triển sau 7 ngày; c. cây phát triển ở giai đoạn bắt đầu ra hoa; d. cây chuyển gen ở giai đoạn trái chín.
Hình 3.31. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen biến nạp ở các dòng T1.
a. gen bar; b. gen cbfd2; c. gen hbfd1; d. gen Zm-psy; L: thang chuẩn 1kb (Promega); P: đối chứng dương pITB-AST; N: cây đối chứng không chuyển gen; 1: D2-1; 2: D2-2; 3:D8-1; 4: D8-2
Kiểm tra tính kháng của cây với thuốc diệt cỏ Basta
Dung dịch thuốc diệt cỏ Basta đƣợc sử dụng để quét lên mặt trên lá của các dòng D2-1, D2-2, D8-1, D8-2 và đối chứng. Kết quả quan sát sau 7 ngày cho thấy lá của 2 dịng D2-1, D8-1 vẫn xanh tốt, hầu nhƣ khơng bị ảnh hƣởng, trong khi lá của dòng D2-2, D8-2 và đối chứng đều bị cháy khơ ở vùng xử lý với Basta (hình 3.32). Điều này chứng tỏ dịng D2-1 và D8-1 nhận đƣợc sự di truyền của gen bar từ cây bố mẹ, sự biểu hiện của gen này giúp cây kháng lại Basta. Dịng D2-2, D8-2 khơng nhận đƣợc sự di truyền gen bar nên không kháng đƣợc Basta, lá bị cháy khơ ở
vùng xử lý.
Hình 3.32. Thử nghiệm quét Basta trên lá cây chuyển gen và đối chứng.a cây đối chứng; b. dòng D2-2; c. dòng D8-2; d. dòng D2-1; e. dòng D8-1 a cây đối chứng; b. dòng D2-2; c. dòng D8-2; d. dòng D2-1; e. dòng D8-1
Kết quả PCR và thử nghiệm Basta trên lá đều cho thấy hai dịng D2-1 và D8- 1 có sự hiện diện và biểu hiện của gen biến nạp, hai dòng D2-2 và D8-2 khơng có sự hiện diện của gen biến nạp. Kết quả này phù hợp với màu sắc của hạt, hai hạt D2-1 và D8-1 màu đỏ, còn hạt D2-2, D8-2 màu trắng. Nhƣ vậy màu đỏ của hạt có thể do sự biểu hiện của các gen biến nạp giúp tạo các hợp chất làm thay đổi màu sắc hạt. Do đó, màu sắc hạt có thể đƣợc sử dụng để sàng lọc bƣớc đầu những hạt có mang gen chuyển.
Các dịng D2-1, D2-2, D8-1, D8-2 phát triển khá tốt trong vƣờn ƣơm, khơng có khác biệt đáng kể về kiểu hình so với đối chứng. Hạt chín đƣợc thu hoạch sau khoảng 4 tháng, số lƣợng hạt đƣợc ghi nhận trong bảng 3.13
ảng 3.13. Kết quả thu nhận hạt của các dòng chuyển gen D2 và D8 ở thế hệ T1
Dòng Hạt màu đỏ Hạt màu trắng D2-1 93 6 D2-2 0 102 D8-1 97 7 D8-2 0 112 Đối chứng 0 109
0,5 cm
Nhƣ vậy, hạt thu đƣợc gồm hai loại màu đỏ và trắng. Trong đó, các dịng D2- 2, D8-2 và đối chứng chỉ thu đƣợc hạt trắng, dòng D2-1 và D8-1 thu đƣợc cả hạt đỏ và trắng. Hạt màu trắng là kiểu màu của hạt đối chứng, không chuyển gen. Nhƣ đã phân tích bằng PCR và tính kháng Basta, hai dịng D2-2, D8-2 khơng mang gen biến nạp nên tồn bộ hạt của các dịng này đều màu trắng hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích trƣớc đó. Hai dịng D2-1, D8-1 nhận đƣợc sự di truyền của gen biến nạp, các cây này tạo đƣợc hạt màu đỏ, chứng tỏ có sự di truyền gen chuyển cho thế hệ sau. Ngồi ra, các dòng này cũng tạo hạt màu trắng, điều này có thể do đây chƣa phải các dịng đồng hợp tử nên có sự phân ly gen biến nạp ở thế hệ tiếp theo.
Màu đỏ hạt của dịng D2-1 và D8-1 đều có sự biến thiên từ nhạt đến đậm (hình 3.33). Ngoài các yếu tố liên quan đến mức độ biểu hiện gen mang tính riêng biệt ở từng trái, vị trí trái trên cây... Sự hiện diện càng nhiều các bản sao của gen biến nạp trong bộ gen hạt có thể dẫn đến tăng cƣờng sự biểu hiện gen và làm hạt có màu đỏ đậm hơn.
Hình 3.33. Các hạt chuyển gen biểu hiện màu đỏ không đồng đều
1. Hạt màu trắng cây đối chứng; 2. Hạt màu trắng cây chuyển gen; 3. Hạt màu đỏ nhạt cây chuyển gen; 4. Hạt màu đỏ đậm cây chuyển gen
Kiểm tra khả năng di truyền và biểu hiện của gen biến nạp ở thế hệ T2
Ở mỗi dòng gieo tất cả các hạt màu trắng, 3 hạt màu đỏ đậm và 3 hạt màu đỏ nhạt trong giấy thấm nƣớc bổ sung 100 mg/l PPT. Kết quả sau 4 ngày chỉ những hạt màu đỏ có khả năng nảy mầm, các hạt trắng chết dần, không nảy mầm. Điều này cho thấy, chỉ những hạt màu đỏ có mang gen biến nạp (gen bar), sự biểu hiện của gen này giúp hạt có khả năng kháng và nảy mầm trong mơi trƣờng có 100 mg/l PPT. Các hạt nảy mầm đƣợc trồng trong chậu đất ngoài vƣờn ƣơm. Kí hiệu các dịng T2 là: D2-1-1 (đỏ đậm), D2-1-2 (đỏ đậm), D2-1-3 (đỏ đậm), D2-1-4 (đỏ nhạt), D2-1-5 (đỏ nhạt),
1 cm
(đỏ nhạt), D8-1-5 (đỏ nhạt), D8-1-6 (đỏ nhạt). Sau khoảng 4 tháng, thu nhận hạt với kết quả nhƣ sau: tất cả các cây trồng từ hạt đỏ đậm ở cả hai dòng D2 và D8 đều tạo hạt màu đỏ (khoảng 100 hạt) với màu đậm nhạt khác nhau (hình 3.34). Hạt của các cây trồng từ hạt đỏ nhạt có sự phân ly màu: D2-1-4 (80 hạt đỏ, 23 hạt trắng), D2-1-5 (75 hạt đỏ, 22 hạt trắng), D2-1-6 (85 hạt đỏ, 26 hạt trắng), D8-1-4 (79 hạt đỏ, 26 hạt trắng), D8-1-5 (87 hạt đỏ, 24 hạt trắng), D8-1-6 (81 hạt đỏ, 22 hạt trắng).
Hình 3.34. Hạt của các dòng chuyển gen T2
a. Tất cả các hạt đều màu đỏ của dòng D2-1-1; b. Hạt màu đỏ (1) và màu trắng (2) của dòng D2-1-4
Các kết quả ghi nhận đƣợc cho thấy đã có sự di truyền của gen biến nạp từ thế hệ T1 đến T2, tất cả các cây T2 đều tạo đƣợc hạt màu đỏ. Ngồi ra, mức độ màu đỏ hạt có thể do ảnh hƣởng của số lƣợng bản sao gen biến nạp hiện diện trong bộ gen hạt, cũng nhƣ vị trí gắn chèn của gen biến nạp trong nhiễm sắc thể cây bố mẹ. Những cây phát triển từ hạt đỏ đậm khơng có sự phân ly màu sắc hạt (đỏ, trắng) ở thế hệ sau, có thể do số lƣợng bản sao của gen biến nạp trong cây bố mẹ nhiều; những cây phát triển từ hạt đỏ nhạt có sự phân ly màu sắc hạt (đỏ, trắng) ở thế hệ sau, có thể do số lƣợng bản sao của gen biến nạp trong cây bố mẹ ít hơn. Do đó màu sắc hạt có thể đƣợc sử dụng để hỗ trợ việc xác định thể đồng hợp tử, từ đó tạo dịng di truyền ổn định gen biến nạp. Nhiều nghiên cứu chuyển gen đã ghi nhận số lƣợng bản sao của gen biến nạp có thể ảnh hƣởng đến mức biểu hiện chung của tính trạng, đặc điểm quan tâm. Shirsat và cộng sự (1989) nhận thấy hàm lƣợng protein ngoại lai legA trong cây N. plumbaginifolia đạt đƣợc ở các mức cao với số lƣợng bản sao
gen biến nạp lớn hơn 1 (khoảng 2-4), chứng tỏ hàm lƣợng protein legA có thể là kết quả của nhiều sự biểu hiện các bản sao gen [184]. Mức độ biểu hiện của gen gfp trên lúa gạo trong nghiên cứu chuyển gen của Zhou và cộng sự (2013) cũng cho thấy có sự tƣơng quan trong sự biểu hiện của gen biến nạp với số lƣợng bản sao, với các dịng có số lƣợng bản sao cao (2-5) thƣờng có biểu hiện gfp cao hơn các dịng có một bản sao. Tuy nhiên, kết quả khơng hồn tồn tuyến tính do sự biểu hiện gen chuyển cịn phụ thuộc vào vị trí gắn chèn trong nhiễm sắc thể [185]. Nghiên cứu chuyển các gen mã hóa enzyme ferredoxin-hydrogenase và Gaussia-Luciferase vào tảo Chlamydomonas reinhardtii của Shahar và cộng sự cũng ghi nhận các kết quả tƣơng tự [186].
Tóm lại, kết quả từ các thí nghiệm trên cho thấy các gen biến nạp đã đƣợc di truyền và biểu hiện ổn định qua nhiều thế hệ. Tuy nhiên, hai dòng chuyển gen T0 ban đầu (D2 và D8) đều mang hai bản sao của gen biến nạp và chỉ tạo đƣợc hai hạt. Do đó khơng thể phân tích qui luật di truyền của các gen biến nạp ở thế hệ tiếp theo. Ngoài ra, việc thu nhận các dòng thuần, đồng hợp tử gen biến nạp có thể đƣợc thực hiện bằng việc gieo các hạt màu đỏ đậm nhất qua nhiều thế hệ để thu nhận dòng tạo đƣợc các hạt đỏ đậm, đồng đều.
3.11.2.6. Phân t ch hàm lượng astaxanthin trong hạt chuyển gen.
Hàm lƣợng astaxanthin trong hạt đậu màu đỏ của hai dòng chuyển gen D2-1 và D8-1 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS tại Trung tâm phân tích trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên tp. HCM.
Mẫu ly trích từ hạt của hai dịng D2-1 và D8-1 đều có sự hiện diện peak ở tỉ số khối lƣợng/điện tích (m/z) đặc trƣng của astaxanthin là 597,39 [187][188][189][190], đồng thời ở mẫu đối chứng khơng chuyển gen khơng có sự hiện diện của peak này, chứng tỏ trong hạt của hai dòng D2-1 và D8-1 đều có astaxanthin (hình 3.35, 3.36, 3.37). Kết quả xác định hàm lƣợng astaxanthin trong hạt đƣợc trình bày trong bảng 3.14.
ảng 3 14 Kết quả định lƣợng astaxanthin trong hạt của các dòng chuyển gen
STT Dòng đậu tƣơng Hàm lƣợng
astaxanthin (µg/g)
01 Đối chứng Khơng phát hiện
02 D2-1 0.31
Astaxanthin đƣợc xác định hiện diện trong hạt của các dòng đậu tƣơng chuyển gen, điều này cho thấy cấu trúc ba gen Zm-psy, cbfd2, hbfd1 biến nạp vào đậu tƣơng đã hoạt động: enzyme ZM-PSY giúp tăng cƣờng con đƣờng chuyển hóa carotenoids (hạt đậu tƣơng chuyển gen đậm màu hơn so với đối chứng); enzyme CBFD2, HBFD1 phối hợp hoạt động qua ba bƣớc, giúp chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin. Nhƣ vậy, con đƣờng chuyển hóa tạo astaxanthin ở cây hoa
Adonis aestivalis đã đƣợc ứng dụng thành công vào đậu tƣơng. Tuy nhiên, hàm
lƣợng astaxanthin trong hạt của hai dòng D2-1 và D8-1 đều tƣơng đối thấp (lần lƣợt đạt 0,31 và 0,77 µg/g) so với nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin trên một số đối tƣợng khác nhƣ ngô đạt 16,77 µg/g [31]; gạo với 16,23 µg/g [8]; đậu tƣơng với 2-7
µg/g [63]… cũng nhƣ so với ly trích từ nguồn tự nhiên nhƣ tảo Haematococcus
pluvialis 20 -50 mg/g trọng lƣợng khô [53][191]; nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous 1,14 – 2,57 mg/g trọng lƣợng khơ tế bào [192][193]. Điều này có thể
do nhiều nguyên nhân nhƣ khác biệt về nguồn gen sử dụng, loại cây biến đổi gen, hơn nữa các cây chuyển gen chƣa phải thể đồng hợp tử, khả năng hoạt động của gen biến nạp phụ thuộc vào vị trí gắn chèn trong bộ nhiễm sắc thể. Do đó, việc tạo thêm nhiều dịng chuyển gen có thể giúp tìm đƣợc dịng có khả năng tổng hợp astaxanthin tối ƣu hơn. Ngoài ra, con đƣờng chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin xúc tác bởi CBFD và HBFD bị cạnh tranh với một enzyme nội sinh khác trong cây là β-ring carotene hydroxylase chuyển hóa β-carotene thành β- cryptoxanthin và zeaxanthin, những hợp chất không thể sử dụng bởi các enzyme CBFD, HBFD. Đây cũng có thể là nguyên nhân ảnh hƣởng đến khả năng hoạt động của CBFD, HBFD làm giảm sự tạo thành astaxanthin. Tuy nhiên, để chứng minh, cần thêm những nghiên cứu nhƣ ức chế hoặc bất hoạt gen mã hóa β-ring carotene hydroxylase [6][19][21].
Hình 3.36. Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dịng D2-1
Hình 3.37. Phổ ESI-MS của mẫu ly trích từ hạt dịng D8-1
3.11.2.7. Đánh giá sự sinh trưởng cây chuyển gen T0, T1 trong điều kiện ex vitro
Nhìn chung cây đậu tƣơng chuyển gen T0 trồng trong vƣờn ƣơm đạt kích thƣớc tối đa lúc cây ra hoa, đậu quả, có kiểu hình các bộ phận tƣơng tự với cây đối
chứng cấy mô và nhỏ hơn nhiều so với cây đối chứng trồng từ hạt (hình 3.38, bảng 3.15). Các bộ phận của cây chuyển gen phát triển bình thƣờng, lá xanh, gồm 3 lá mỗi nhánh, hình dạng phiến lá bình thƣờng, thân thẳng, hoa màu tím nhạt, hình dạng cánh hoa nhƣ cây đối chứng. Thời gian từ khi trồng đến lúc quả chín, thu hạt khoảng 4 tháng, giống với cây đối chứng. Ngồi kiểu hình, đặc điểm khác biệt lớn giữa cây chuyển gen, đối chứng cấy mô so với cây đối chứng trồng từ hạt là khả năng sinh sản cây chuyển gen, đối chứng cấy mô thấp hơn nhiều so với cây đối