CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. Biến đổi gen thực vật
1.2.1. Chuyển gen vào thực vật sử dụng Agrobacterium tumefaciens
Phân loại Giới : Bacterium Ngành : Proteobacteria Lớp : Alpha Proteobacteria Bộ : Rhizobiales Họ : Rhizobiaceae Chi : Agrobacterium
Loài : Agrobacterium tumefaciens
Trong tự nhiên A. tumefaciens là một loại vi khuẩn đất, gram âm, gây bệnh trên thực vật, chủ yếu ở cây 2 lá mầm với triệu chứng điển hình là tạo thành khối u trên thân, rễ. Trong quá trình gây bệnh, A. tumefaciens chuyển một đoạn DNA của mình vào bộ gen cây [69]. Dựa vào khả năng này, hiện nay A. tumefaciens đã đƣợc
sử dụng phổ biến để chuyển nhiều loại gen ngoại lai qui định các đặc tính khác nhau vào thực vật nhƣ tính kháng sâu, thuốc diệt cỏ, khả năng khử độc môi trƣờng, gia tăng chất dinh dƣỡng, tổng hợp dƣợc phẩm... [70].
Cấu trúc giúp A. tumefaciens có khả năng chuyển gen nằm trên Ti-plasmid
(Tumour inducing plasmid) với các đặc tính điển hình: kích thƣớc khoảng 200 - 800 kb, dạng vịng xoắn kép [55]. Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng là vùng T- DNA (transferred DNA) và vùng gây độc (virulence - vir gen). Vùng gen vir gồm những gen mã hóa cho các protein cần thiết cho sự tổng hợp, vận chuyển và hợp nhất của vùng T-DNA vào tế bào chủ. Vùng gen vir có kích thƣớc khoảng 30 - 40
kb, gồm 6 operon quan trọng là: VirA, VirB, VirC, VirD, VirE, VirG và 2 operon khác ít quan trọng hơn là VirF và VirH [73][74].
Vùng T-DNA trên Ti-plasmid đóng vai trị quan trọng trong kỹ thuật chuyển gen sử dụng A. tumefaciens, đây chính là vùng đƣợc chuyển vào tế bào thực vật, so với T-DNA tự nhiên, vùng T-DNA sử dụng trong kỹ thuật chuyển gen có nhiều cải biến gồm: sự loại bỏ các gen gây độc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và thay thế bởi các gen mong muốn biểu hiện trong thực vật nhƣ gen kháng sâu bệnh, chậm chín trái... Đồng thời khi biến nạp với A. tumefaciens, chỉ một số ít tế bào nhận
đƣợc sự hòa nhập bền vững gen mong muốn vào bộ gen nhân. Do đó cần thiết phải cấu trúc thêm các gen chọn lọc (selectable marker genes) và gen chỉ thị (reporter genes) trong cấu trúc đồng chuyển với gen mong muốn trên T-DNA.
Gen chọn lọc: đƣợc sử dụng để chọn lọc thể chuyển gen, mã hóa 1 protein
cho phép những tế bào chuyển gen có khả năng phát triển trên mơi trƣờng có những hợp chất độc với tế bào khơng chuyển gen. Gen chọn lọc có thể mã hóa một enzyme
Hình 1.9. Vi khuẩn A. tumefaciens bám
trên bề mặt tế bào thực vật [71]
Hình 1.10. Vi khuẩn A. tumefaciens gây
giải độc giúp phân hủy tác nhân chọn lọc, hoặc mã hóa cho một enzyme khơng nhạy cảm với sự ức chế của tác nhân chọn lọc, enzyme này sẽ thay thế enzyme đã bị biến đổi trong thể chuyển gen. Những gen chọn lọc thƣờng đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu chuyển gen vào thực vật gồm: nptII, hpt, bar... [75]
Hình 1.11. Sự ức chế của phosphinothricin lên hoạt động của enzyme
glutamine synthetase (GS)
Gen bar đƣợc phân lập từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase có khả năng phosphoryl hóa và làm mất hoạt tính của phosphinothricin, đây là một loại thuốc diệt cỏ, đƣợc bổ sung vào môi trƣờng để sàng lọc thể chuyển gen. Phosphinothricin ức chế enzyme glutamine synthetase (GS) trong tế bào thực vật do đó cản trở tế bào tổng hợp glutamine, đồng thời làm gián đoạn q trình chuyển hóa NH4+, dẫn đến sự tích lũy amonia trong tế bào thực vật (hình 1.11). Amonia tích tụ nhiều sẽ trở thành chất độc gây chết tế bào thực vật, chỉ những tế bào đƣợc chuyển gen bar mới có khả năng bất hoạt
phosphinothricin và sống đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc [76].
Gen chỉ thị: mã hóa sản phẩm thấy đƣợc, dùng để phát hiện thể chuyển gen,
ví dụ nhƣ: gus, luc, gfp, trong đó gus là gen đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật chuyển gen thực vật. Gen gus do Jelferson phân lập từ E. coli năm 1986, mã
hóa protein β-glucuronidase, là một hydrolase xúc tác sự phân giải các β- glucuronide tạo ra sản phẩm có màu xanh chàm đặc trƣng, bền, dễ nhận biết (hình
1.12). β-glucuronide thƣờng dùng nhất để nhận biết sự tồn tại của gen gus là X-
Gluc (5-bromo-4-clo-3-indolyl--D-glucoronide).
Hình 1.12. Phản ứng của X-Gluc với -glucuronidase [77]
Ƣu và nhƣợc điểm của phƣơng pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Ưu điểm: Đây là phƣơng pháp chuyển gen tƣơng đối đơn giản, hiệu quả, không cần sử dụng những thiết bị phức tạp, cho phép chuyển những đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng đối lớn, ít xảy ra đứt gãy hoặc tái sắp xếp lại trình tự nên các gen có tính tồn vẹn và biểu hiện ổn định ở mức độ cao trong tế bào chủ. Ngoài ra số lƣợng bản sao của gen biến nạp trong tế bào chủ thƣờng thấp do đó giảm ảnh hƣởng đến hoạt động của bộ gen cây chủ.
Nhược điểm: các chủng A. tumefaciens có phạm vi ký chủ tƣơng đối hẹp, chủ yếu là cây hai lá mầm và một số cây một lá mầm. Tuy nhiên, dựa trên những hiểu biết về cơ chế chuyển gen vào tế bào thực vật của A. tumefaciens cùng với sự chọn lọc, cải thiện đối với các dòng A. tumefaciens tự nhiên, phạm vi ký chủ của A. tumefaciens ngày càng đƣợc mở rộng [74][78].