Cây chuyển gen To (a), đối chứng từ hạt (b), chuyển gen T1 (c) sau 6 tuần; cây chuyển gen To (d), đối chứng (e), chuyển gen T1 (f) sau 14 tuần.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt là mầm và một nửa hạt
Hạt đậu tƣơng đƣợc khử trùng bằng khí clo trong 16 giờ giúp tạo mẫu sạch và giữ khả năng nảy mầm của hạt tốt nhất. BA 2 mg/l là nồng độ tối ƣu để cảm ứng tạo chồi từ đốt lá mầm và một nửa hạt của ba giống MTĐ 176; HL 07-15 và OMĐN 29. Ngoài ra, IBA 1 mg/l và 1,5 mg/l lần lƣợt là nồng độ tối ƣu để cảm ứng tạo rễ từ mẫu chồi của hai giống MTĐ 176; HL 07-15 và giống OMĐN 29.
Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng
Nồng độ PPT tối ƣu để chọn lọc chồi chuyển gen của giống MTĐ 176, OMĐN 29 và HL 07-15 lần lƣợt là 6, 5 và 5 mg/l. Ngoài ra, bổ sung PPT từ 1 mg/l trong mơi trƣờng ni cấy có thể giúp duy trì áp lực chọn lọc cho chồi chuyển gen. Kim châm nhiều mũi đƣợc sử dụng để đâm nhẹ 3 lần lên vùng đốt lá mầm sẽ tạo vết thƣơng mẫu phù hợp cho các nghiên cứu chuyển gen.
Mẫu đốt lá mầm đƣợc tạo vết thƣơng bằng dao mổ và kết hợp xử lý với sóng siêu âm 30s hoặc thấm hút chân không 60s (-20 in Hg) sẽ giúp tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng, từ 1,67% lên 10% (sóng siêu âm) và từ 1,67%
lên 8,33% (thấm hút chân không).
Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen.
Phƣơng pháp tạo vết thƣơng vùng đốt lá mầm (giống MTĐ 176) bằng cách sử dụng kim châm đâm nhẹ 3 lần để thay thế dao mổ đã giúp tăng hiệu quả chuyển gen tạo astaxanthin từ 0,33% lên 1%. Ngồi ra, việc kết hợp sử dụng sóng siêu âm 30s hoặc thấm chân khơng 60s (-20 in Hg) trong q trình tạo vết thƣơng mẫu đốt lá mầm cũng giúp tăng hiệu quả chuyển gen từ 0,67 % lên 2%.
Nghiên cứu đã tạo đƣợc nhiều dòng đậu tƣơng biến đổi gen, trong đó 2 dịng có khả năng tạo hạt và sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt. Hàm lƣợng
astaxanthin trong hạt thế hệ T1 của hai dòng đậu tƣơng chuyển gen lần lƣợt là 0,31 µg/g (D2) và 0,77 µg/g (D8). Các dịng đậu tƣơng chuyển gen có khả năng di truyền và biểu hiện gen biến nạp qua nhiều thế hệ. Trong các giai đoạn sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ năng suất hạt cho thấy cây chuyển gen và đối chứng khơng có nhiều khác biệt.
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu đã cho thấy bằng cách sử dụng các phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu thích hợp nhƣ dùng kim châm đâm nhẹ vùng đốt lá mầm hoặc tạo vết thƣơng có sự kết hợp của sóng siêu âm, thấm hút chân khơng có thể giúp nâng cao đáng kể hiệu quả chuyển gen vào giống MTĐ 176 nên có thể đƣợc áp dụng để tăng hiệu quả chuyển gen vào các giống đậu tƣơng khác.
Phƣơng pháp tạo vết thƣơng bằng kim châm nhiều mũi hoặc tạo vết thƣơng trong qui trình chuyển gen vào đốt lá mầm đã giúp nâng cao đáng kể hiệu quả chuyển gen vào giống đậu tƣơng MTĐ 176 nên có thể đƣợc áp dụng
Các hạt đậu tƣơng màu đỏ đậm cần tiếp tục đƣợc gieo trồng thêm nhiều thế hệ để nhận đƣợc các cây tạo hạt đỏ đậm, khơng phân ly. Sau đó các cây này cần đƣợc đánh giá về khả năng sinh trƣởng, phát triển, năng suất tạo hạt, hàm lƣợng astaxanthin trong hạt nhằm định hƣớng khả năng ứng dụng tạo sản phẩm chứa astaxanthin nguồn gốc tự nhiên.
Việc tăng cƣờng hơn con đƣờng chuyển hóa hƣớng đến sự tạo astaxanthin có thể đƣợc thực hiện thông qua một số định hƣớng nhƣ chuyển thêm gen mã hóa phytoene desaturase, bất hoạt gen mã hóa enzyme lycopene e-cyclase để hƣớng tiền chất vào nhánh β,β hoặc bất hoạt gen mã hóa enzyme β-ring carotene hydroxylase. Mặc dù, một số nghiên cứu tạo cây bắp và lúa biến đổi gen sản xuất astaxanthin đã biến nạp thành công cấu trúc gồm 5 gen, tuy nhiên việc đƣa thêm các yếu tố mới vào cấu trúc 4 gen hiện tại (bar, Zm-psy, cbfd2, hbfd1) cần đƣợc thực hiện lần lƣợt từng yếu tố nhằm đánh giá ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp gen cũng nhƣ sự biểu hiện ổn định của các gen này.
DANH MỤC CƠNG TRÌNH
1. Hồng Văn Dƣơng, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Huỳnh Cẩm Tú,
Nguyễn Hữu Hổ, Tăng hiệu quả chuyển gen vào cây đậu nành bằng phương
pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm, thấm chân khơng, Công Nghệ Sinh Học, 2017, 15 (3A), 185-194.
2. Hoàng Văn Dƣơng, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Sử dụng kim châm trên đốt lá mầm trong chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo astaxanthin ở cây đậu nành, Công nghệ sinh
học, 2017, 15 (4A), 55-62.
3. Hoàng Văn Dƣơng, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Huỳnh Cẩm Tú,
Trần Thị Ngọc Hà, Nguyễn Hữu Hổ, Tạo cây đậu tương chuyển gen có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Kỷ yếu Hội Nghị Cơng Nghệ Sinh Học Tồn Quốc 2020, NXB Đại Học Huế, 2020, 22-28.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. G. Goswami, S. Chaudhuri, D. Dutta, The present perspective of astaxanthin with
reference to biosynthesis and pharmacological importance, World Journal of
Microbiology and Biotechnology, 2010, 26 (11), 1925-1939.
2. R.G. Fassett, J.S. Coombes, Astaxanthin: a potential therapeutic agent in cardiovascular disease, Marine drugs, 2011, 9 (3), 447-465.
3. M. Shah, R. Mahfuzur, Y. Liang, J.J. Cheng, M. Daroch, Astaxanthin-producing
green microalga Haematococcus pluvialis: from single cell to high value commercial products, Frontiers in plant science, 2016, 7, 531.
4. A. Molino, J. Rimauro, P. Casella, A. Cerbone, V. Larocca, S. Chianese, D. Karatza, S. Mehariya, A. Ferraro, E. Hristoforou, Extraction of astaxanthin from microalga Haematococcus pluvialis in red phase by using generally recognized as safe solvents and accelerated extraction, Journal of
biotechnology, 2018, 283, 51-61.
5. J.L. Barredo, C. García-Estrada, K. Kosalkova, C. Barreiro, Biosynthesis of astaxanthin as a main carotenoid in the heterobasidiomycetous yeast Xanthophyllomyces dendrorhous, Journal of Fungi, 2017, 3 (3), 44.
6. F.X. Cunningham, E. Gantt, Elucidation of the pathway to astaxanthin in the flowers of Adonis aestivalis, The Plant Cell, 2011, 23 (8), 3055-3069.
7. J.C. Huang, Y.J. Zhong, J. Liu, G. Sandmann, F. Chen, Metabolic engineering of
tomato for high-yield production of astaxanthin, Metabolic engineering, 2013,
17, 59-67.
8. Q. Zhu, D. Zeng, S. Yu, C. Cui, J. Li, H. Li, J. Chen, R. Zhang, X. Zhao, L. Chen, From golden rice to a STARice: bioengineering Astaxanthin biosynthesis in rice endosperm, Molecular plant, 2018, 11 (12), 1440-1448.
9. J. Alcaíno, M. Baeza, V. Cifuentes, Carotenoid distribution in nature,
Carotenoids in Nature, 2016, 3-33.
10. G. Britton, Carotenoid research: History and new perspectives for chemistry in
biological systems, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell
11. E. Alós, M.J. Rodrigo, L. Zacarias, Manipulation of carotenoid content in plants
to improve human health. Carotenoids in Nature, Springer, 2016, 311-343.
12. D. Gayen, S. Ghosh, S. Paul, S.N. Sarkar, S.K. Datta, K. Datta, Metabolic regulation of carotenoid-enriched golden rice line, Frontiers in plant science,
2016, 7, 1622.
13. X. Zheng, G. Giuliano, S. Al-Babili, Carotenoid biofortification in crop plants:
citius, altius, fortius, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and
Cell Biology of Lipids, 2020, 1865 (11), 158664.
14. S. Fakhri, F. Abbaszadeh, L. Dargahi, M. Jorjani, Astaxanthin: A mechanistic review on its biological activities and health benefits, Pharmacological
research, 2018, 136, 1-20.
15. S. Davinelli, M.E. Nielsen, G. Scapagnini, Astaxanthin in skin health, repair, and disease: A comprehensive review, Nutrients, 2018, 10 (4), 522.
16. B. Capelli, S. Talbott, L. Ding, Astaxanthin sources: Suitability for human health and nutrition, Functional Foods in Health and Disease, 2019, 9 (6),
430-445.
17. S.H.A. Raza, S.R.Z. Naqvi, S.A. Abdelnour, N. Schreurs, Z.M. Mohammedsaleh, I. Khan, A.F. Shater, M.E. Abd El-Hack, A.F. Khafaga, G. Quan, Beneficial effects and health benefits of Astaxanthin molecules on animal production: A review, Research in Veterinary Science, 2021, 138, 69-
78.
18. W. Xia, N. Tang, H.K. Varkaneh, T.Y. Low, S.C. Tan, X. Wu, Y. Zhu, The effects of astaxanthin supplementation on obesity, blood pressure, CRP, glycemic biomarkers, and lipid profile: A meta-analysis of randomized controlled trials, Pharmacological research, 2020, 105113.
19. N. Nisar, L. Li, S. Lu, N.C. Khin, B.J. Pogson, Carotenoid metabolism in plants, Molecular plant, 2015, 8 (1), 68-82.
20. T. Sun, H. Yuan, H. Cao, M. Yazdani, Y. Tadmor, L. Li, Carotenoid metabolism in plants: the role of plastids, Molecular plant, 2018, 11 (1), 58-
21. R. Baranski, C. Cazzonelli, Carotenoid biosynthesis and regulation in plants.
Carotenoids: Nutrition, Analysis and Technology, Wiley-Blackwell Hoboken, 2016, 161-189.
22. F. Cunningham, E. Gantt, Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in plants, Annual review of plant biology, 1998, 49 (1), 557-583.
23. C.A. Howitt, B.J. Pogson, Carotenoid accumulation and function in seeds and non‐green tissues, Plant, cell & environment, 2006, 29 (3), 435-445.
24. A.S. Hermanns, X. Zhou, Q. Xu, Y. Tadmor, L. Li, Carotenoid pigment accumulation in horticultural plants, Horticultural Plant Journal, 2020, 6 (6),
343-360.
25. P.D. Fraser, S. Römer, J.W. Kiano, C.A. Shipton, P.B. Mills, R. Drake, W. Schuch, P.M. Bramley, Elevation of carotenoids in tomato by genetic manipulation, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81 (9),
822-827.
26. P.D. Fraser, P.M. Bramley, The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids, Progress in lipid research, 2004, 43 (3), 228-265.
27. C.K. Shewmaker, J.A. Sheehy, M. Daley, S. Colburn, D.Y. Ke, Seed‐specific overexpression of phytoene synthase: increase in carotenoids and other metabolic effects, The Plant Journal, 1999, 20 (4), 401-412.
28. J.A. Paine, C.A. Shipton, S. Chaggar, R.M. Howells, M.J. Kennedy, G. Vernon, S.Y. Wright, E. Hinchliffe, J.L. Adams, A.L. Silverstone, Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content,
Nature Biotechnology, 2005, 23 (4), 482.
29. G. Diretto, S. Al-Babili, R. Tavazza, V. Papacchioli, P. Beyer, G. Giuliano,
Metabolic engineering of potato carotenoid content through tuber-specific overexpression of a bacterial mini-pathway, PLoS One, 2007, 2 (4), e350.
30. M. Aluru, Y. Xu, R. Guo, Z. Wang, S. Li, W. White, K. Wang, S. Rodermel,
Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content, Journal
of experimental Botany, 2008, 59 (13), 3551-3562.
31. G. Farré, L. Perez-Fons, M. Decourcelle, J. Breitenbach, S. Hem, C. Zhu, T. Capell, P. Christou, P.D. Fraser, G. Sandmann, Metabolic engineering of
astaxanthin biosynthesis in maize endosperm and characterization of a prototype high oil hybrid, Transgenic Research, 2016, 25 (4), 477-489.
32. C. Li, J. Ji, G. Wang, Z. Li, Y. Wang, Y. Fan, Over-Expression of LcPDS, LcZDS, and LcCRTISO, Genes From Wolfberry for Carotenoid Biosynthesis, Enhanced Carotenoid Accumulation, and Salt Tolerance in Tobacco, Frontiers
in plant science, 2020, 11, 119.
33. R.P. McQuinn, B. Wong, J.J. Giovannoni, AtPDS overexpression in tomato: exposing unique patterns of carotenoid self‐regulation and an alternative strategy for the enhancement of fruit carotenoid content, Plant biotechnology
journal, 2018, 16 (2), 482-494.
34. Z. Zhao, Z. Liu, X. Mao, Biotechnological Advances in Lycopene β-Cyclases,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68 (43), 11895-11907. 35. A. Hannoufa, Z. Hossain, Regulation of carotenoid accumulation in plants,
Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2012, 1 (3), 198-202.
36. M. Hayashi, T. Ishibashi, D. Kuwahara, K. Hirasawa, Commercial Production of Astaxanthin with Paracoccus carotinifaciens, Carotenoids: Biosynthetic and
Biofunctional Approaches, 2021, 1261, 11-20.
37. K. Bernhard, Synthetic astaxanthin. The route of a carotenoid from research to
commercialisation. Carotenoids, Springer, 1989, 337-363.
38. M. Rodríguez-Sáiz, J.L. de la Fuente, J.L. Barredo, Xanthophyllomyces dendrorhous for the industrial production of astaxanthin, Applied
microbiology and biotechnology, 2010, 88 (3), 645-658.
39. A. Mortensen, L.H. Skibsted, Importance of carotenoid structure in radical- scavenging reactions, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45
(8), 2970-2977.
40. R. Ambati, S.-M. Phang, S. Ravi, R. Aswathanarayana, Astaxanthin: sources, extraction, stability, biological activities and its commercial applications-a review, Marine drugs, 2014, 12 (1), 128-152.
41. L. Ekpe, K. Inaku, V. Ekpe, Antioxidant effects of astaxanthin in various diseases??? a review, Journal of Molecular Pathophysiology, 2018, 7 (1), 1-6.
42. J. Dose, S. Matsugo, H. Yokokawa, Y. Koshida, S. Okazaki, U. Seidel, M. Eggersdorfer, G. Rimbach, T. Esatbeyoglu, Free radical scavenging and cellular antioxidant properties of astaxanthin, International journal of
molecular sciences, 2016, 17 (1), 103.
43. B. Capelli, S. Talbott, L. Ding, F. Capelli, Efficacy of astaxanthin from different
sources: Reports on the suitability for human health and nutrition, Global
Perspectives on Astaxanthin, 2021, 391-409.
44. G. Hussein, U. Sankawa, H. Goto, K. Matsumoto, H. Watanabe, Astaxanthin, a carotenoid with potential in human health and nutrition, Journal of natural
products, 2006, 69 (3), 443-449.
45. F.J. Pashkow, D.G. Watumull, C.L. Campbell, Astaxanthin: a novel potential treatment for oxidative stress and inflammation in cardiovascular disease, The
American journal of cardiology, 2008, 101 (10), 58-68.
46. K.C. Lim, F.M. Yusoff, M. Shariff, M.S. Kamarudin, Astaxanthin as feed supplement in aquatic animals, Reviews in Aquaculture, 2018, 10 (3), 738-
773.
47. M. Ahuja, J. Varavadekar, M. Vora, P. Sethia, H. Reddy, V. Rangaswamy,
Astaxanthin: Current Advances in Metabolic Engineering of the Carotenoid,
High Value Fermentation Products: Human Health, 2019, 1, 381-399.
48. C.V.G. Prieto, F.D. Ramos, V. Estrada, M.A. Villar, M.S. Diaz, Optimization of
an integrated algae-based biorefinery for the production of biodiesel, astaxanthin and PHB, Energy, 2017, 139, 1159-1172.
49. B. Stachowiak, P. Szulc, Astaxanthin for the Food Industry, Molecules, 2021,
26 (9), 2666.
50. S. Jannel, Y. Caro, M. Bermudes, T. Petit, Novel insights into the biotechnological production of Haematococcus pluvialis-derived astaxanthin: Advances and key challenges to allow its industrial use as novel food ingredient, Journal of Marine Science and Engineering, 2020, 8 (10), 789.
51. T. Goodwin, The biochemistry of the carotenoids. II. Animals, Chapmann and
52. T. Matsuno, Aquatic animal carotenoids, Fisheries science, 2001, 67 (5), 771-
783.
53. S. Boussiba, Carotenogenesis in the green alga Haematococcus pluvialis: cellular physiology and stress response, Physiologia Plantarum, 2000, 108 (2),
111-117.
54. T. Goodwin, Biosynthesis of carotenoids, Springer, (1980), Netherlands.
55. J. Kim, J.J. Smith, L. Tian, D. DellaPenna, The evolution and function of carotenoid hydroxylases in Arabidopsis, Plant and cell physiology, 2009, 50
(3), 463-479.
56. D. Han, Y. Li, Q. Hu, Astaxanthin in microalgae: pathways, functions and biotechnological implications, Algae, 2013, 28 (2), 131.
57. L. Fan, A. Vonshak, R. Gabbay, J. Hirshberg, Z. Cohen, S. Boussiba, The biosynthetic pathway of astaxanthin in a green alga Haematococcus pluvialis as indicated by inhibition with diphenylamine, Plant and cell physiology,
1995, 36 (8), 1519-1524.
58. G. Sandmann, Genetic manipulation of carotenoid biosynthesis: strategies, problems and achievements, Trends in plant science, 2001, 6 (1), 14-17.
59. V. Mann, M. Harker, I. Pecker, J. Hirschberg, Metabolic engineering of astaxanthin production in tobacco flowers, Nature Biotechnology, 2000, 18
(8), 888.
60. T. Hasunuma, S.I. Miyazawa, S. Yoshimura, Y. Shinzaki, K.I. Tomizawa, K. Shindo, S.K. Choi, N. Misawa, C. Miyake, Biosynthesis of astaxanthin in tobacco leaves by transplastomic engineering, The Plant Journal, 2008, 55 (5),
857-868.
61. H. Harada, T. Maoka, A. Osawa, J.-i. Hattan, H. Kanamoto, K. Shindo, T. Otomatsu, N. Misawa, Construction of transplastomic lettuce (Lactuca sativa)
dominantly producing astaxanthin fatty acid esters and detailed chemical analysis of generated carotenoids, Transgenic Research, 2014, 23 (2), 303-
62. D. Jia, L. Fan, J. Shen, S. Qin, F. Li, Y. Yuan, Genetic transformation of the astaxanthin biosynthetic genes bkt and crtR-B into apple tree to increase photooxidation resistance, Scientia Horticulturae, 2019, 243, 428-433.
63. E.C. Pierce, P.R. LaFayette, M.A. Ortega, B.L. Joyce, D.A. Kopsell, W.A. Parrott, Ketocarotenoid production in soybean seeds through metabolic engineering, PLoS One, 2015, 10 (9), e0138196.
64. G. Keshavareddy, A. Kumar, V.S. Ramu, Methods of Plant Transformation-A Review, Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci, 2018, 7 (7), 2656-2668.
65. N.K. Dhal, M.B.R. Sahu, M.A. Sushree, A Review on Plant Transformation Methods, International Journal of Modern Agriculture, 2020, 9 (3), 757-763.
66. J.C. Sanford, T.M. Klein, E.D. Wolf, N. Allen, Delivery of substances into cells
and tissues using a particle bombardment process, Particulate Science and
Technology, 1987, 5 (1), 27-37.
67. G. Atiq, N. Nasrullah Khan, M.A.R. Raheem, R.K. Iqbal, Plant Transformation
in Biotechnology, Middle East Journal of Applied Science & Technology
(MEJAST), 2019, 2 (3), 103-123.
68. A. Harkess (2019). Smashing Barriers in Biolistic Plant Transformation, American Society of Plant Biologists.
69. G.A. De La Riva, J. González-Cabrera, R. Vázquez-Padrón, C. Ayra-Pardo,
Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation,
Electronic journal of Biotechnology, 1998, 1 (3), 24-25.
70. A. Ziemienowicz, Agrobacterium-mediated plant transformation: factors, applications and recent advances, Biocatalysis and Agricultural
Biotechnology, 2014, 3 (4), 95-102.
71. A. Graves, S. Goldman, S. Banks, A. Graves, Scanning electron microscope studies of Agrobacterium tumefaciens attachment to Zea mays, Gladiolus sp., and Triticum aestivum, Journal of bacteriology, 1988, 170 (5), 2395-2400.
72. H. Mafakheri, S.M. Taghavi, Z. Banihashemi, E. Osdaghi, J.R. Lamichhane,