CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Nội dung và Phƣơng pháp
2.2.2. Khử trùng hạt
Khử trùng bằng khí clo
Cho hạt đậu tƣơng vào đĩa petri 90 x 15 mm trải thành một lớp. Xếp các đĩa này, với nắp đƣợc để mở, và một cốc đong 250 ml vào bình hút ẩm kín. Cho vào cốc đong 100 ml nƣớc Javel (Hàm lƣợng clo 38 g/l) và thêm 3,5 ml HCl (12 N) bằng cách đổ dọc theo thành cốc. Đóng nắp bình hút ẩm và giữ trong thời gian khác nhau (16, 24 giờ). Sau thời gian tiếp xúc với khí clo, đóng các đĩa petri đựng hạt và đƣa vào tủ cấy vô trùng. Mở đĩa cho khí clo bay tồn bộ ra ngoài trong 30 phút [111].
Khử trùng bằng dung dịch Javel
Hạt đậu tƣơng đƣợc khử trùng bằng cách ngâm vào dung dịch nƣớc Javel 50% (hàm lƣợng clo 38 g/l) trong các thời gian khác nhau 30, 40, 50 phút, sau đó
rửa sạch mẫu lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng [102][150].
Hạt sau khi khử trùng bởi các tác nhân đƣợc cấy trên mơi trƣởng rắn gồm khống MS, vitamin B5, pH 5,6 [111][154]. Các nghiệm thức đƣợc thực hiện với 12 mẫu/bình mơi trƣờng, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ hạt không nhiễm, tỉ lệ hạt không nhiễm nảy mầm.
2.2.3. Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm và một nửa hạt
Khảo sát ảnh hƣởng BA lên khả năng tạo chồi bất định của đốt lá mầm và một nửa hạt. Qua đó xác định mơi trƣờng thích hợp kích thích tạo chồi.
Phƣơng pháp khử trùng hạt áp dụng theo qui trình tối ƣu nhận đƣợc từ mục 2.2.2. Mẫu đốt lá mầm đƣợc chuẩn bị theo qui cách của Hinchee và cộng sự (1988), Olhoft và cộng sự (2003) [121][126] (QC 1) với các bƣớc gồm gieo hạt đậu trên môi trƣờng MS-vitamin B5 trong 5 ngày để hạt nảy mầm. Sau đó, cây nảy mầm đƣợc loại bỏ phần rễ, giữ lại đoạn trụ dƣới lá mầm dài khoảng 3 -5 mm, liền với lá mầm. Dùng dao mổ 15 tách rời hai lá mầm bằng cách chẻ dọc từ đốt đến hết đoạn trụ dƣới lá mầm, rồi loại bỏ chồi đỉnh, chồi bên. Tiếp theo cắt nhẹ 7 lần theo phƣơng vng góc với trụ dƣới lá mầm để tạo vết thƣơng cho vùng mô phân sinh nách. Mẫu đốt lá mầm gồm lá mầm, đoạn trụ dƣới lá mầm, vùng phân sinh nách, đƣợc dùng để cảm ứng chồi (hình 2.1).
Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc chuẩn bị mẫu đốt lá mầm
Mẫu một nửa hạt đƣợc chuẩn bị theo qui cách của Paz và cộng sự (2006) [111] (QC 2) với các bƣớc thực hiện gồm ngâm hạt đậu trong nƣớc cất vô trùng
khoảng 20 giờ. Sau đó, tách đơi hai lá mầm dọc theo phần rốn hạt (hilum). Tiếp theo, loại bỏ trục phơi (hình 2.2).
Hình 2.2. Sơ đồ các bƣớc chuẩn bị mẫu một nửa hạt
Đốt lá mầm và một nửa hạt chuẩn bị theo các cách trên đƣợc đặt lên môi trƣờng tái sinh SI bổ sung BA (0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3) mg/l. Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hồn tồn ngẫu nhiên. Mẫu đƣợc nuôi trên kệ sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cƣờng độ 2.000 - 3.000 lux, nhiệt độ 25±2oC. Ghi nhận kết quả sau 3 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu tái sinh chồi, số chồi tái sinh trung bình (số chồi tái sinh/số mẫu khảo sát), hình thái chồi bình thƣờng, đồng đều.
Cụm chồi hình thành trên mơi trƣờng tạo chồi tối ƣu, đƣợc chuyển sang môi trƣờng tăng trƣởng thân SE. Các chồi cao khoảng 3 cm đƣợc tách riêng và cấy lên môi trƣờng khảo sát tạo rễ.
2.2.4. Ảnh hưởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro
Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ IBA thích hợp kích thích tạo rễ cho chồi
in vitro để tạo cây con hoàn chỉnh.
Chồi in vitro cao khoảng 3 cm đƣợc cấy lên mơi trƣờng khống MS, vitamin B5, 0,59 g/l MES, bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau (0; 0,5; 1; 1,5; 2) mg/l, PH 5,6. Ghi nhận kết quả sau 3 tuần nuôi cấy.
Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hồn tồn ngẫu nhiên.
Điều kiện ni cấy: mẫu đƣợc nuôi cấy trên kệ sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cƣờng độ 2.000 - 3.000 lux, nhiệt độ 25±2oC.
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ chồi tạo rễ, số rễ trung bình (số rễ tạo thành/số mẫu khảo sát).
Hạt đậu tƣơng Hạt đậu tƣơng ngâm
Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng
2.2.5. Ảnh hưởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt
Khảo sát ảnh hƣởng của PPT ở các nồng độ khác nhau lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm để xác định nồng độ thích hợp cho chọn lọc chồi chuyển gen.
Đốt lá mầm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo chồi tối ƣu, bổ sung chất chọn lọc PPT ở các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 mg/l). Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hồn tồn ngẫu nhiên. Mẫu đƣợc nuôi cấy trên kệ sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cƣờng độ 2.000 - 3.000 lux, nhiệt độ 25±2oC. Ghi nhận kết quả sau 3 tuần
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu chết, khơng tái sinh, hình thái mẫu.
2.2.6. Ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng của chồi in vitro
Khảo sát ảnh hƣởng của PPT, ở các nồng độ khác nhau, lên khả năng tạo rễ, phát triển của chồi in vitro, từ đó xác định nồng độ PPT thích hợp duy trì áp lực chọn lọc trong giai đoạn tạo rễ, phát triển cây in vitro.
Chồi in vitro cao khoảng 3 cm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo rễ RM, bổ sung PPT ở các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/l). Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hoàn toàn ngẫu nhiên. Mẫu đƣợc nuôi cấy trên dàn sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cƣờng độ 2.000 - 3.000 lux, nhiệt độ 25±2oC. Ghi nhận kết quả sau 3 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ chồi sống, phát triển, hình thái chồi.
2.2.7. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện nhằm xác định cách thức tạo vết thƣơng bằng kim châm thích hợp để vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhiễm, chuyển gen, đồng thời không ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh của mẫu. Thu nhận đốt lá mầm từ cây nảy mầm 5 ngày tuổi theo phƣơng pháp của Hinchee và cộng sự (1988), Olhoft và cộng sự (2003) [121][126]. Để tạo vết thƣơng, kim châm đƣợc sử dụng để đâm nhẹ (sâu khoảng 1 mm) lên vùng mơ phân sinh. Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức, trong đó nghiệm thức đối chứng không sử dụng kim châm. Số lần châm từ 1 đến 5 tƣơng ứng với các nghiệm thức còn lại. Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí
nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hồn tồn ngẫu nhiên. Mẫu đƣợc ni cấy trên kệ sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cƣờng độ 2.000 - 3.000 lux, nhiệt độ 25±2oC. Ghi nhận kết quả sau 3 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu tái sinh chồi.
2.2.8. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương
Nghiên cứu chuyển gen vào đốt lá mầm đậu tƣơng dựa theo phƣơng pháp mô tả bởi Olhoft và cộng sự (2003) [126]. Trong đó, mẫu đốt lá mầm đƣợc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp với xử lý sóng siêu âm nhằm tăng khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn, qua đó giúp nâng cao hiệu quả chuyển gen.
Tạo vết thương vùng đốt lá mầm: Đốt lá mầm, từ cây nảy mầm 5 ngày tuổi
của giống MTĐ 176, đƣợc tạo vết thƣơng lên vùng mô phân sinh nách bằng cách dùng dao mổ 15 cắt nhẹ 5 lần theo phƣơng vng góc với trụ dƣới lá mầm. Sau đó tiến hành xử l với sóng siêu âm trƣớc khi xâm nhiễm với vi khuẩn, thời gian xử l siêu âm lần lƣợt là: 0, 15, 30, 45, 60 giây.
Chuẩn bị vi khuẩn cho thí nghiệm chuyển gen: vi khuẩn A. tumefaciens mang
plasmid pCAMBIA3301 đƣợc nuôi cấy lắc qua đêm trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trƣờng Luria Bertani (LB) lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin và rifamycin nồng độ 50 mg/l ở 28oC, 220 vòng/phút (OD620nm = 0,8 – 1,0). Sau đó ly tâm thu phần lắng vi khuẩn ở 4000 vòng/phút, 10 phút, 22oC. Hòa vi khuẩn trong 50 ml mơi trƣờng lây nhiễm IF, bổ sung acetosyringone 100 µM, lắc nhẹ khoảng 1 giờ trƣớc khi sử dụng xâm nhiễm mẫu.
Gây nhiễm mô thực vật với vi khuẩn: mẫu thực vật sau khi tạo vết thƣơng đƣợc ngâm vào dung dịch vi khuẩn đã pha lỗng trong 30 phút, sau đó thấm bớt dịch vi khuẩn trên mô bằng giấy lọc vô trùng và cấy chuyển sang môi trƣờng đồng nuôi cấy với mặt trong của lá mầm tiếp xúc với môi trƣờng, ở nhiệt độ khoảng 24oC trong tối, thời gian 5 ngày. Trên bề mặt môi trƣờng đặt một lớp giấy thấm để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn.
Tái sinh chọn lọc chồi chuyển gen: Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu đƣợc rửa loại bỏ vi khuẩn bám bên ngồi với mơi trƣờng SI lỏng bổ sung 500 mg/l cefotaxime. Một nửa số mẫu sau khi đƣợc rửa sạch vi khuẩn sẽ đƣợc nhuộm GUS
để kiểm tra biểu hiện GUS tạm thời. Một nửa số mẫu còn lại của mỗi nghiệm thức đƣợc cấy lên môi trƣờng tái sinh SI bổ sung kháng sinh cefotaxime 500 mg/l và nồng độ chất chọn lọc PPT tối ƣu từ các khảo sát trên. Cấy chuyền mẫu sang mơi trƣờng mới 2 tuần/lần. Chồi hình thành sau 1 tháng trên môi trƣờng SI đƣợc nhuộm GUS để kiểm tra hiệu quả chuyển gen.
Nhuộm GUS mẫu chuyển gen: cho mẫu cần nhuộm GUS vào ống falcon 50 ml, thêm aceton 90% lạnh vào ngập mẫu. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Rửa mẫu bằng nƣớc lạnh. Thêm dung dịch nhuộm GUS vào ngập mẫu. Bọc kín và ủ qua đêm ở 37oC. Sau đó, bỏ hết dung dịch nhuộm GUS và thay bằng cồn 96% ủ ở 65oC đến khi mất màu diệp lục. Kiểm tra mẫu nhuộm GUS và ghi nhận bằng hình ảnh.
Mỗi nghiệm thức gồm 40 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hoàn toàn ngẫu nhiên.
2.2.9. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương
Thí nghiệm nhằm xác định thời gian tối ƣu xử l mẫu đốt lá mầm trong môi trƣờng áp suất âm để tăng khả năng chuyển gen.
Phương pháp thực hiện: quá trình chuyển gen, chọn lọc chồi và nhuộm GUS
đƣợc thực hiện nhƣ thí nghiệm trên. Tuy nhiên mẫu đốt lá mầm sau khi chuẩn bị từ cây nảy mầm, đƣợc ngâm trong dung dịch vi khuẩn A. tumefaciens và đƣa vào môi trƣờng chân không ở -20 in Hg với các thời gian khác nhau: 0s, 15s, 30s, 45s, 60s thay vì sử dụng sóng siêu âm. Thấm hút chân không đƣợc tạo ra bằng cách chuyển mẫu ngâm trong dung dịch vi khuẩn vào buồng hút chân không của máy bắn gen, thực hiện hút chân không đến áp lực - 20 in Hg, sau đó duy trì áp lực này với các khoảng thời gian nhƣ trên.
Mỗi nghiệm thức gồm 40 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hoàn toàn ngẫu nhiên.
Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen.
2.2.10. Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST
Plasmid pITB-AST đƣợc tách chiết từ chủng vi khuẩn E. coli DH5α bằng
phƣơng pháp Calci nhiệt. Kiểm tra plasmid bằng phƣơng pháp cắt giới hạn plasmid và PCR.
Biến nạp plasmid vào vi khuẩn bằng phƣơng pháp Calci nhiệt [156]
Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào A. tumefaciens khả nạp thông qua xử lý
sốc nhiệt kết hợp CaCl2. CaCl2thúc đẩy sự kết hợp giữa DNA plasmid và màng tế bào. Sự thay đổi nhanh nhiệt độ sẽ tạo ra các lỗ thủng trên màng cho phép DNA plasmid xâm nhập vào bên trong tế bào.
Chuẩn bị tế bào vi khuẩn khả nạp
Một khuẩn lạc vi khuẩn riêng lẻ đƣợc cấy vào trong 20 ml môi trƣờng LB và ủ qua đêm (12 - 16 giờ) ở 28oC, lắc 220 vịng/phút. Sau đó, pha lỗng dịch ni cấy ở trên theo tỉ lệ 1:20 trong dung dịch LB (1 ml cho 20 ml) và tiếp tục ủ lắc ở điều kiện nhƣ trên khoảng 3 - 4 giờ cho đến khi OD600nm của dịch vi khuẩn bằng 1. Dịch vi khuẩn đƣợc ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút để làm lắng tế bào vi khuẩn, đổ bỏ phần dịch môi trƣờng và hòa nhẹ nhàng vào phần cặn vi khuẩn dung dịch 0,1M CaCl2 lạnh. Ủ lạnh dịch huyền phù vi khuẩn ít nhất trong 30 phút rồi phân ra 200 l vào mỗi ống Eppendorf 1,5 ml đã đƣợc ủ lạnh trƣớc.
Biến nạp plasmid vào vi khuẩn, chọn lọc khuẩn lạc biến nạp
Khoảng 0,1 - 0,5 g plasmid đƣợc cho vào ống chứa 200 l dịch tế bào khả nạp, ủ trong nitrogen lỏng khoảng 90 giây. Sau đó, chuyển nhanh ống sang nhiệt độ 37oC trong 5 phút, đặt lại trong đá khoảng 2 phút. Tiếp theo, cho vào ống 1 ml mơi trƣờng LB khơng có kháng sinh. Ni lắc ở 37oC trong 2 giờ rồi ly tâm ở 3000 v/p trong 1 phút và loại bỏ phần lớn dịch nổi bên trên (chỉ chừa lại một ít dịch). Hịa tan nhẹ vi khuẩn vào phần dịch còn lại và trải dịch vi khuẩn trên môi trƣờng LB rắn bổ sung 50 mg/l kanamycin và 50 mg/l rifampicin, ủ qua đêm ở 28 oC.
Kết quả biến nạp thể hiện qua các khuẩn lạc có khả năng kháng kháng sinh mọc đƣợc trên đĩa môi trƣờng sau hai ngày nuôi cấy. Chọn những khuẩn lạc màu trắng, to và tách rời trên mơi trƣờng xem nhƣ là các dịng vi khuẩn giả định biến nạp để kiểm tra.
Các dòng vi khuẩn này đƣợc cấy vào mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc và ni cấy lắc qua đêm. Plasmid đƣợc ly trích từ sinh khối bằng bộ kit QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN).
Kiểm tra sự hiện diện của plasmid bằng phƣơng pháp cắt bằng enzyme giới hạn và PCR
Phương pháp cắt giới hạn
Plasmid, sau khi ly trích, đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI (cho một
băng cắt kích thƣớc 15,5 kb); EcoRI và HindIII (cho hai băng cắt kích thƣớc 13,8
kb và 1,7 kb). Sản phẩm cắt đƣợc điện di và so sánh kích thƣớc dựa trên sơ đồ thiết kế để nhận dạng plasmid pITB-AST.
Hỗn hợp phản ứng enzyme giới hạn gồm các thành phần: DNA plasmid (15
l), buffer (2 l), hai enzyme EcoRI và HindIII (2 l/ enzyme), BSA (1 l). Tổng
thể tích: 20 l. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 2 - 3 giờ ở 37 oC, sau đó điện di cùng với thang chuẩn -HindIII trên bản gel 1% agarose trong dung dịch TAE.
Phương pháp PCR
Thành phần phản ứng và qui trình thực hiện đƣợc trình bày trong mục 2.2.12 để kiểm tra sự hiện diện của các gen trên plasmid pITB-AST.
2.2.11. Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương
2.2.11.1. Chuyển gen vào đốt lá mầm dùng kim châm và dao mổ tạo vết thương Tạo vết thương vùng đốt lá mầm: Đốt lá mầm đƣợc tạo vết thƣơng với hai
phƣơng pháp là dùng dao mổ hoặc kim châm. Phƣơng pháp dùng dao mổ: sử dụng dao 15 cắt nhẹ 7 lần lên vùng mô phân sinh nách, với phƣơng vng góc với trụ mầm [121][126]. Phƣơng pháp dùng kim châm: dùng kim châm đâm nhẹ với số lần châm tối ƣu nhận đƣợc từ khảo sát trên.
Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pITB-AST cho thí nghiệm chuyển gen: thực hiện nhƣ mơ tả ở mục 2.2.8.
Tái sinh chọn lọc cây chuyển gen: Sau q trình đồng ni cấy, mẫu đƣợc loại bỏ vi khuẩn bằng dung dịch rửa bổ sung 500 mg/l cefotaxime. Tiếp theo, chọn lọc chồi chuyển gen trong 4 tuần bằng cách cấy lên môi trƣờng tái sinh chồi SI bổ sung cefotaxime 500 mg/l và nồng độ chất chọn lọc PPT tối ƣu từ các khảo sát trên. Chồi hình thành đƣợc phát triển chiều cao thân trên môi trƣờng SE. Khi chồi cao