a. Tất cả các hạt đều màu đỏ của dòng D2-1-1; b. Hạt màu đỏ (1) và màu trắng (2) của dòng D2-1-4
Các kết quả ghi nhận đƣợc cho thấy đã có sự di truyền của gen biến nạp từ thế hệ T1 đến T2, tất cả các cây T2 đều tạo đƣợc hạt màu đỏ. Ngoài ra, mức độ màu đỏ hạt có thể do ảnh hƣởng của số lƣợng bản sao gen biến nạp hiện diện trong bộ gen hạt, cũng nhƣ vị trí gắn chèn của gen biến nạp trong nhiễm sắc thể cây bố mẹ. Những cây phát triển từ hạt đỏ đậm khơng có sự phân ly màu sắc hạt (đỏ, trắng) ở thế hệ sau, có thể do số lƣợng bản sao của gen biến nạp trong cây bố mẹ nhiều; những cây phát triển từ hạt đỏ nhạt có sự phân ly màu sắc hạt (đỏ, trắng) ở thế hệ sau, có thể do số lƣợng bản sao của gen biến nạp trong cây bố mẹ ít hơn. Do đó màu sắc hạt có thể đƣợc sử dụng để hỗ trợ việc xác định thể đồng hợp tử, từ đó tạo dịng di truyền ổn định gen biến nạp. Nhiều nghiên cứu chuyển gen đã ghi nhận số lƣợng bản sao của gen biến nạp có thể ảnh hƣởng đến mức biểu hiện chung của tính trạng, đặc điểm quan tâm. Shirsat và cộng sự (1989) nhận thấy hàm lƣợng protein ngoại lai legA trong cây N. plumbaginifolia đạt đƣợc ở các mức cao với số lƣợng bản sao
gen biến nạp lớn hơn 1 (khoảng 2-4), chứng tỏ hàm lƣợng protein legA có thể là kết quả của nhiều sự biểu hiện các bản sao gen [184]. Mức độ biểu hiện của gen gfp
trên lúa gạo trong nghiên cứu chuyển gen của Zhou và cộng sự (2013) cũng cho thấy có sự tƣơng quan trong sự biểu hiện của gen biến nạp với số lƣợng bản sao, với các dịng có số lƣợng bản sao cao (2-5) thƣờng có biểu hiện gfp cao hơn các dịng có một bản sao. Tuy nhiên, kết quả khơng hồn tồn tuyến tính do sự biểu hiện gen chuyển cịn phụ thuộc vào vị trí gắn chèn trong nhiễm sắc thể [185]. Nghiên cứu chuyển các gen mã hóa enzyme ferredoxin-hydrogenase và Gaussia-Luciferase vào tảo Chlamydomonas reinhardtii của Shahar và cộng sự cũng ghi nhận các kết quả tƣơng tự [186].
Tóm lại, kết quả từ các thí nghiệm trên cho thấy các gen biến nạp đã đƣợc di truyền và biểu hiện ổn định qua nhiều thế hệ. Tuy nhiên, hai dòng chuyển gen T0 ban đầu (D2 và D8) đều mang hai bản sao của gen biến nạp và chỉ tạo đƣợc hai hạt. Do đó khơng thể phân tích qui luật di truyền của các gen biến nạp ở thế hệ tiếp theo. Ngồi ra, việc thu nhận các dịng thuần, đồng hợp tử gen biến nạp có thể đƣợc thực hiện bằng việc gieo các hạt màu đỏ đậm nhất qua nhiều thế hệ để thu nhận dòng tạo đƣợc các hạt đỏ đậm, đồng đều.
3.11.2.6. Phân t ch hàm lượng astaxanthin trong hạt chuyển gen.
Hàm lƣợng astaxanthin trong hạt đậu màu đỏ của hai dòng chuyển gen D2-1 và D8-1 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS tại Trung tâm phân tích trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên tp. HCM.
Mẫu ly trích từ hạt của hai dịng D2-1 và D8-1 đều có sự hiện diện peak ở tỉ số khối lƣợng/điện tích (m/z) đặc trƣng của astaxanthin là 597,39 [187][188][189][190], đồng thời ở mẫu đối chứng không chuyển gen khơng có sự hiện diện của peak này, chứng tỏ trong hạt của hai dịng D2-1 và D8-1 đều có astaxanthin (hình 3.35, 3.36, 3.37). Kết quả xác định hàm lƣợng astaxanthin trong hạt đƣợc trình bày trong bảng 3.14.
ảng 3 14 Kết quả định lƣợng astaxanthin trong hạt của các dòng chuyển gen
STT Dòng đậu tƣơng Hàm lƣợng astaxanthin (µg/g) 01 Đối chứng Khơng phát hiện
02 D2-1 0.31
Astaxanthin đƣợc xác định hiện diện trong hạt của các dòng đậu tƣơng chuyển gen, điều này cho thấy cấu trúc ba gen Zm-psy, cbfd2, hbfd1 biến nạp vào
đậu tƣơng đã hoạt động: enzyme ZM-PSY giúp tăng cƣờng con đƣờng chuyển hóa carotenoids (hạt đậu tƣơng chuyển gen đậm màu hơn so với đối chứng); enzyme CBFD2, HBFD1 phối hợp hoạt động qua ba bƣớc, giúp chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin. Nhƣ vậy, con đƣờng chuyển hóa tạo astaxanthin ở cây hoa
Adonis aestivalis đã đƣợc ứng dụng thành công vào đậu tƣơng. Tuy nhiên, hàm
lƣợng astaxanthin trong hạt của hai dòng D2-1 và D8-1 đều tƣơng đối thấp (lần lƣợt đạt 0,31 và 0,77 µg/g) so với nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin trên một số đối tƣợng khác nhƣ ngơ đạt 16,77 µg/g [31]; gạo với 16,23 µg/g [8]; đậu tƣơng với 2-7 µg/g [63]… cũng nhƣ so với ly trích từ nguồn tự nhiên nhƣ tảo Haematococcus pluvialis 20 -50 mg/g trọng lƣợng khô [53][191]; nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous 1,14 – 2,57 mg/g trọng lƣợng khơ tế bào [192][193]. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân nhƣ khác biệt về nguồn gen sử dụng, loại cây biến đổi gen, hơn nữa các cây chuyển gen chƣa phải thể đồng hợp tử, khả năng hoạt động của gen biến nạp phụ thuộc vào vị trí gắn chèn trong bộ nhiễm sắc thể. Do đó, việc tạo thêm nhiều dịng chuyển gen có thể giúp tìm đƣợc dịng có khả năng tổng hợp astaxanthin tối ƣu hơn. Ngồi ra, con đƣờng chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin xúc tác bởi CBFD và HBFD bị cạnh tranh với một enzyme nội sinh khác trong cây là β-ring carotene hydroxylase chuyển hóa β-carotene thành β-cryptoxanthin và zeaxanthin, những hợp chất không thể sử dụng bởi các enzyme CBFD, HBFD. Đây cũng có thể là nguyên nhân ảnh hƣởng đến khả năng hoạt động của CBFD, HBFD làm giảm sự tạo thành astaxanthin. Tuy nhiên, để chứng minh, cần thêm những nghiên cứu nhƣ ức chế hoặc bất hoạt gen mã hóa β-ring carotene hydroxylase [6][19][21].