CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Nội dung và Phƣơng pháp
2.2.13. Kiểm tra cây chuyển gen bằng Southern blot
Dùng phƣơng pháp tạo mẫu dò và phát hiện bằng CDP-Star của Amersham (GE Healthcare - RPN 3682) để phân tích các dịng cây đậu tƣơng chuyển gen. Q trình thực hiện nhƣ sau:
Chuẩn bị mẫu và chạy điện di: Cho 10 µg DNA của mỗi dịng chuyển nạp
gen, đối chứng âm (cây không đƣợc chuyển nạp gen), đối chứng dƣơng (plasmid pITB-AST) ủ với enzyme giới hạn HindIII hoặc HindIII và EcoRI ở 37oC trong 4-5 giờ (Trong phản ứng 50 µl: 5 đơn vị Enzyme cho 1µg DNA, buffer có nồng độ cuối là 2X, thêm nƣớc vừa đủ 50 µl). Điện di mẫu DNA sau khi cắt bởi enzym trên gel 1% agarose (A9539 Sigma), ở 25 vol qua đêm cùng với thang chuẩn Lambda DNA/HindIII. Chụp ảnh bản gel bằng máy chụp Gel-Documentation.
Chuyển DNA từ gel lên màng: bản gel đƣợc đặt vào hộp đựng 300ml dung
dịch lọc trong, lắc nhẹ trong 10 phút, rồi bỏ dung dịch, tráng bằng nƣớc cất. Sau đó, gel đƣợc ngâm trong dung dịch biến tính, lắc nhẹ 15 phút trong khi ngâm gel, lặp lại
bƣớc này hai lần, rồi rửa gel bằng nƣớc cất. Tiếp theo, trung hoà gel trong dung dịch trung hòa, lắc nhẹ 15 phút trong khi ngâm gel, lặp lại hai lần bƣớc này. Dung dịch 20X SSC đƣợc đổ vào khay có miếng kiếng thủy tinh đặt trên thành khay, dùng giấy thấm phủ lên tấm kiếng và hai đầu giấy nhúng vào dung dịch 20X SSC. Để gel vào trên giấy thấm, phủ màng Hypond-N đã thấm ƣớt bằng dung dịch 20X SSC lên trên miếng gel sao cho khơng có bọt khí. Đặt tiếp 3 miếng giấy thấm 3MM (đã thấm ƣớt bằng dung dịch 20X SSC) có kích thƣớc bằng miếng gel lên trên màng, rồi phủ một chồng giấy thấm lên phía trên. Cuối cùng, đặt một vật nặng lên trên cùng và để qua đêm.
Chuẩn bị mẫu dò (Probe): Mẫu dị là trình tự DNA 500 bp đã đƣợc tinh
sạch của gen cbfd2 tạo ra từ phản ứng PCR. Mẫu dò cho thang chuẩn HindIII cũng đƣợc thực hiện cùng với mẫu dò cho gen cbfd2. DNA mẫu dị đƣợc pha lỗng với
nƣớc trong bộ kit để có nồng độ 10 ng/µl. Sau đó, biến tính 10 µl DNA (100 ng DNA) trong nƣớc đang sôi 5 phút. Tiếp theo, làm lạnh trên đá trong 5 phút và ly tâm để DNA xuống đáy. Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng (reaction buffer) và 2 µl dung dịch đánh dấu (labelling reagent), trộn đều nhẹ. 10µl dung dịch cross linker đƣợc thêm vào, rồi trộn đều và ly tâm để DNA xuống đáy. Cuối cùng, hỗn hợp đƣợc ủ ở 37oC trong 30 phút. Probe có thể dùng ngay hoặc giữ trên đá trong 2 giờ, giữ đến 6 tháng trong 50% glycerol ở -20oC.
Lai DNA: Dung dịch lai đƣợc làm nóng trƣớc trong buồng lai (Techne) lên
55oC ít nhất 15 phút. DNA đƣợc gắn chặt trên màng bằng cách xử lý màng trong máy UVP TL – 2000 Ultra violet Translinker với thời gian 30 giây mỗi mặt. Sau đó, bỏ màng lai vào ống lai và lai qua đêm ở 55oC.
Rửa mẫu sau lai DNA: dung dịch rửa 1 đƣợc làm nóng lên 55oC. Sau đó, cho dung dịch rửa 1 vào ống lai chứa màng (2-5ml/cm2 màng), đặt vào máy lai trong 10 phút ở nhiệt độ 55oC, lặp lại thêm một lần. Tiếp theo, lấy màng ra cho vào hộp sạch có chứa dung dịch rửa 2, lắc nhẹ trong thời gian 5 phút, lặp lại thêm một lần.
Phát hiện DNA bằng cơ chất: Màng đƣợc lấy ra khỏi dung dịch rửa 2, đặt
lên miếng plastic. Sau đó, cho dung dịch phát hiện (RPN 3682) lên màng (30-40 µl/cm2) và ủ khoảng 5 phút. Tiếp theo, đặt miếng plastic khác lên trên, loại bỏ dung
dịch phát hiện còn dƣ, vuốt nhẹ cho hết bọt khí. Cuối cùng, hiện phim bằng Amersham HyperfilmTM ECL (GE Healthcare) với thời gian khác nhau.
2.2.14. Phân tích hàm lượng astaxanthin trong hạt
Astaxanthin trong hạt đậu tƣơng đƣợc định tính và định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (HPLC-MS) thực hiện tại Trung tâm phân tích trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên tp. HCM.
Hạt đậu tƣơng đƣợc sấy khô đến khối lƣợng khơng đổi ở 50oC sau đó nghiền nhuyễn rồi ly trích carotenoid tổng. Tiếp theo, mẫu đƣợc phân tích định tính và định lƣợng astaxanthin theo qui trình của Trung tâm phân tích trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM dựa trên hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp Agilent 1900 (USA) và hệ thống khối phổ MS/MS phân giải cao 6500 series Q-TOF (Agilent). Tất cả các dữ liệu đƣợc ghi và xử lý trên phần mềm Masshunter quanlitative analysis B.07.00 của Agilent.
Điều kiện chạy sắc ký: pha động gồm pha A là H2O chứa 0.1 % acid formic, pha B là 95% ACN chứa 0.1 % acid formic. Pha tĩnh là cột Waters spherusorb S5 C8 (2.0 150mm), đƣợc ổn nhiệt ở 40 0C. Mẫu đƣợc tiêm vào cột với thể tích 10 µl. Tốc độ dịng pha động là 0.5 ml/phút.
2.2.15. Đánh giá các giai đoạn sinh trưởng cây chuyển gen trong điều kiện ex vitro
Đánh giá kiểu hình qua các giai đoạn phát triển: Cây chuyển gen và đối chứng đƣợc trồng ở cùng điều kiện trong vƣờn ƣơm. Theo dõi, ghi nhận sự phát triển kiểu hình, năng suất hạt trong quá trình phát triển của cây. Sau đó, so sánh để xem xét sự gắn chèn của các gen biến nạp có ảnh hƣởng lớn tới sự sinh trƣởng, phát triển của cây.
Điều kiện nhà trồng cây chuyển gen (vƣờn ƣơm), qui trình làm việc đảm bảo an toàn sinh học cây biến đổi gen: Cây chuyển gen trồng trong điều kiện nhà kín để hạn chế sự phát tán các vật liệu, sinh vật biến đổi gen ra mơi trƣờng bên ngồi. Nhà kín làm bằng vật liệu polycacbonate trong, giúp trao đổi ánh sáng tự nhiên với bên ngồi. Nhiệt độ trong phịng đƣợc điều chỉnh ở 27-28oC. Nhà kín nằm bên trong nhà lƣới, giúp tạo thêm cách ly vật lý với bên ngồi bằng lƣới ngăn cơn trùng. Để đảm bảo không phát tán vật liệu biến đổi gen ra ngồi mơi trƣờng, trong q trình thí
nghiệm, khơng mang các dụng cụ thí nghiệm ra ngồi khu vực nhà kín. Sau khi thí nghiệm, tồn bộ vật liệu liên quan đến cây biến đổi gen (thân, lá...) đƣợc hấp tiệt trùng ở 121oC/20 phút. Các dụng cụ đƣợc rửa sạch bằng chất tẩy Javel, xà phòng.
Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao cây, đƣờng kính thân, số nhánh cây, số lƣợng hạt, đƣờng kính hạt, trọng lƣợng hạt.
Cách tính đƣờng kính hạt: Đƣờng kính hạt = (chiều dài + chiều rộng + độ dày)/3 [158]. Chiều dài, chiều rộng, độ dày hạt xác định nhƣ hình 2.3.
Hình 2.3. Minh họa kích thƣớc theo chiều dài, rộng, dày của hạt đậu tƣơng
Cách tính đƣờng kính thân: đƣờng kính thân xác định bằng cách đo đƣờng kính đoạn thân trong khoảng từ nhánh 1 đến nhánh 2.
Đánh giá tính kháng thuốc trừ cỏ Basta của cây đậu tƣơng chuyển gen:
Cây đậu tƣơng chuyển gen có mang gen kháng glufosinate, hợp chất chính trong thuốc trừ cỏ Basta. Do đó, kiểm tra tính kháng của cây với Basta giúp xác định khả năng biến nạp cũng nhƣ biểu hiện của gen chuyển. Thử nghiệm quét dung dịch Basta ở nồng độ gây chết (100 mg/l glufosinate) lên mặt trên lá cây chuyển gen và đối chứng đƣợc thực hiện khi cây khoảng 1 tháng tuổi. Thuốc trừ cỏ Basta (100 mg/l glufosinate) đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng từ nồng độ gốc 200 g/l glufosinate, bổ sung thêm 50 µl tween 20 trong 50 ml dung dịch. Kết quả đƣợc ghi nhận sau 7 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi: sự mất màu diệp lục, hình thái lá.
2.2.16. Xử lý thống kê
Các nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại ba lần. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0, kiểm tra mức độ khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phƣơng pháp LSD hoặc Duncan với P ≤ 0,05. Các số liệu là tỉ lệ phần trăm biến động từ 0 - 100% đƣợc chuyển đổi sang dạng Arcsin√x và số chồi/mẫu, số rễ/chồi sang dạng Log(x+1) trƣớc khi xử lý thống kê [159].
Chiều dài
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt.
3.1. Tuyển chọn các giống đậu tƣơng
Bảy giống đậu tƣơng đã đƣợc thu thập, trong đó các giống MTĐ 176; MTĐ 760-4; MTĐ 860-3; MTĐ 885-1; HL 07-15; OMĐN 29 là các giống lai đã đƣợc thuần hóa, giống Edamame là giống nhập từ Nhật có hạt to dùng để ăn trực tiếp hạt non.
Phân tích hàm lƣợng β-carotene trong hạt của các giống đậu tƣơng đã thu thập bằng phƣơng pháp HPLC cho thấy ở tất cả các giống đều có sự hiện diện của β-carotene, tuy nhiên với hàm lƣợng thấp, trong đó giống MTĐ 176 có hàm lƣợng 1,97 µg/g (bảng 3.1).
Nhiều nghiên cứu phân tích hàm lƣợng β-carotene trong các giống đậu tƣơng khác nhau cũng ghi nhận hàm lƣợng khá thấp của loại carotenoid này trong hạt đậu tƣơng, trong nghiên cứu của Panwar và cộng sự 2015, ghi nhận hàm lƣợng β- carotene của giống Pusa (Ấn Độ) bằng HPLC, chỉ đạt 0,02 µg/g; nghiên cứu của Schmidt và cộng sự (2015) trên giống Jack đạt 0,5 µg/g [160][161]. Gần đây, nghiên cứu của Gebregziabher và cộng sự (2021) khi phân tích hàm lƣợng β- carotene trên các giống đậu tƣơng Trung Quốc bằng HPLC đã ghi nhận hàm lƣợng lớn hơn nằm trong khoảng 3,25-6,61 µg/g [162]. Nhƣ vậy, mặc dù hàm lƣợng β- carotene có sự thay đổi giữa các giống đậu tƣơng khác nhau nhƣng nhìn chung sự tích lũy β-carotene trong hạt đậu tƣơng khá thấp. Tuy nhiên, do β-carotene là tiền chất để tổng hợp astaxanthin nên việc tăng cƣờng con đƣờng tổng hợp β-carotene là điều cần thiết trong chiến lƣợc thu nhận astaxanthin. Trong nghiên cứu này, gen mã hóa enzyme phytoene synthase sẽ đƣợc chuyển vào đậu tƣơng để tăng cƣờng sinh tổng hợp phytoene, là tiền chất có thể thúc đẩy chuỗi chuyển hóa nhằm tổng hợp β- carotene ở mức độ cao hơn.
Các giống trong bộ giống đậu thu thập đƣợc đều ghi nhận có sự hiện diện của β-carotene nên đủ điều kiện để thực hiện chuyển gen theo chiến lƣợc đã đề ra. Tuy nhiên để đảm bảo sự ổn định và hiệu quả trong q trình thí nghiệm, các hạt giống đƣợc kiểm tra tỉ lệ nảy mầm bằng cách gieo trên giấy thấm ƣớt đặt trong đĩa petri.
ảng 3.1. Kiểm tra thành phần β-carotene ở các giống đậu tƣơng. Giống đậu tƣơng MTĐ176 MTĐ 760-4 MTĐ 860-3 MTĐ 885-1 Edamame HL 07-15 OMĐN 29 β-carotene 1,97 µg/g Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Kết quả ghi nhận tỉ lệ nảy mầm cho thấy 4 giống MTĐ 176, HL 07-15; OMĐN 29 và Edamame có tỉ lệ nảy mầm cao (96-97%), 3 giống MTĐ 760-4; MTĐ 860-3; MTĐ 885-1 có tỉ lệ nảy mầm thấp hơn (89-92%) (bảng 3.2). Ngoài ra, lá mầm của giống Edamame dễ bị nứt, vỡ nên khơng thích hợp dùng cho các thí nghiệm cấy mơ, chuyển gen (hình 3.1). Từ các kết quả này, hạt của 3 giống MTĐ 176, HL 07-15; OMĐN 29 đƣợc chọn để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo của đề tài. Trong đó giống MTĐ 176 đƣợc Trần Thị Cúc Hịa (2008) ghi nhận có khả năng chuyển gen cao [163].
ảng 3.2. Tỉ lệ nảy mầm ở các giống đậu tƣơng
Giống đậu tƣơng MTĐ 176 MTĐ 760-4 MTĐ 860-3 MTĐ 885-1 Edamame HL 07-15 OMĐN 29 Tỉ lệ nảy mầm (%) 96 90 89 92 96 97 96
Hình 3.1. Hạt đậu tƣơng nảy mầm sau 5 ngày
a, b, c, d, e, f tương ứng với hạt đậu tương các giống MTĐ 860, MTĐ 760-4, MTĐ 885-1, Edamame, HL 07-15, OMĐN 29, MTĐ 176
a b c d
e f g
3.2. Hiệu quả của các phƣơng pháp khử trùng hạt đậu tƣơng
Phƣơng pháp xử lý hạt đậu tƣơng với khí clo hoặc dung dịch Javel 50% ở các khoảng thời gian khác nhau đã đƣợc khảo sát. Với các nghiệm thức khử trùng bằng dung dịch Javel 50%, kết quả cho thấy thời gian xử lý mẫu có ảnh hƣởng đến hiệu quả khử trùng và khả năng nảy mầm của hạt (bảng 3.3). Ở thời gian xử lý 30 phút, vẫn còn mẫu nhiễm. Khi tăng thời gian khử trùng lên 40 phút và 50 phút đã tạo đƣợc mẫu sạch 100%, tuy nhiên tỉ lệ mẫu nảy mầm giảm đáng kể ở cả hai giống HL 07-15 và OMĐN 29. Nghiệm thức tối ƣu khi khử trùng bằng dung dịch Javel 50% tƣơng ứng với thời gian xử lý 40 phút có tỉ lệ hạt nảy mầm giảm cịn 75% (HL07- 15) và 77,78% (OMĐN 29).
Các nghiệm thức khử trùng bằng khí clo trong 16 hoặc 24 giờ đều tạo mẫu sạch 100%. Với thời gian xử lý 16 giờ nhận đƣợc tỉ lệ nảy mầm cao nhất là 94,44% (HL 07-15) và 91,67% (OMĐN 29), khi tăng thời gian xử lý lên 24 giờ làm giảm rõ rệt tỉ lệ nảy mầm (hình 3.2). Ngồi ra, khử trùng bằng khí clo giúp hạt nảy mầm đồng đều, thời gian nảy mầm ngắn, sau 5-6 ngày cây mầm vƣơn dài, lá mầm tách vỏ và chuyển màu xanh. Khử trùng bằng dung dịch Javel 50% làm thời gian cây nảy mầm chậm hơn 1-2 ngày, cây nảy mầm không đều. Nhiều nghiên cứu trên các giống đậu tƣơng khác nhau cũng ghi nhận thời gian khử trùng bằng clo phù hợp là khoảng 16 giờ [111][125][164], có thể kéo dài đến 24 giờ [126][165]. Thời gian khử trùng tối ƣu có thể cịn phụ thuộc vào điều kiện của hạt (mức độ sạch ban đầu, điều kiện bảo quản hạt...), tuy nhiên để đảm bảo tỉ lệ hạt nảy mầm, sức sống cây mầm, thời gian hạt tiếp xúc khí clo khơng nên kéo dài. Kết quả ghi nhận ở thí nghiệm này cho thấy thời gian khử trùng hạt chỉ nên giới hạn ở khoảng 16 giờ. Khử trùng hạt là bƣớc chuẩn bị mẫu đầu tiên trong thí nghiệm chuyển gen, đóng vai trị quan trọng ảnh hƣởng đến sự ổn định và thành công của các bƣớc tiếp theo. Ở giai đoạn này, mẫu hạt phải đƣợc khử trùng hoàn toàn đồng thời khả năng nảy mầm, sức sống của hạt khơng bị ảnh hƣởng nhiều, từ đó đảm bảo đƣợc khả năng tái sinh, tạo chồi cao của mẫu ở thí nghiệm tái sinh. Các yếu tố này sẽ góp phần quyết định sự thành cơng của q trình tạo mẫu, cây chuyển gen.
Tóm lại, khử trùng bằng khí clo trong thời gian 16 giờ đƣợc chọn áp dụng cho các giống đậu tƣơng trong nghiên cứu nhằm tạo ra nguồn nguyên liệu sạch, có sức sống, khả năng nảy mầm tốt và đồng đều giúp cho các thí nghiệm có thể bố trí ổn định, độ đồng nhất cao và hiệu quả. Thí nghiệm sử dụng hai giống HL 07-15 và OMĐN 29, kết quả tối ƣu đƣợc áp dụng cho giống MTĐ 176.
Hình 3.2. Hạt đậu tƣơng (HL 07-15) nảy mầm 5 ngày sau khi khử trùng . a. khí clo 16 giờ, b. Khí clo 24 giờ, c. Dung dịch Javel 50% 30 phút, d. Dung dịch a. khí clo 16 giờ, b. Khí clo 24 giờ, c. Dung dịch Javel 50% 30 phút, d. Dung dịch Javel 50% 40 phút, e. Dung dịch Javel 50% 50 phút
ảng 3.3. Tỉ lệ hạt đậu tƣơng không nhiễm và nảy mầm khi khử trùng bằng dung
dịch Javel hoặc khí clo. Tác nhân khử
trùng, thời gian
Tỉ lệ hạt không nhiễm (%)
Tỉ lệ hạt không nhiễm nảy mầm (%)1 HL 07-15 OMĐN 29 HL 07-15 OMĐN 29 Khí clo, 16 giờ 100 100 94,44 a 91,67 a Khí clo, 24 giờ 100 100 52,78 c 66,67 bc Javel 50%, 30 p 97,22 94,44 83,33 b 86,11 a Javel 50%, 40 p 100 100 75,00 b 77,78 ab Javel 50%, 50 p 100 100 52,78 c 50,00 c
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 theo kiểm định thống kê LSD. Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√xtrước khi xử lý thống kê.
3.3. Ảnh hƣởng của BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt
Nghiên cứu khả năng cảm ứng tạo chồi bất định của BA ở các nồng độ khác nhau đƣợc thực hiện trên 3 giống MTĐ 176, HL 07-15, OMĐN 29 với 2 qui cách mẫu đốt lá mầm (QC1) và một nửa hạt (QC2).
Nhìn chung sự cảm ứng chồi của BA với hai loại mẫu của cả ba giống đậu tƣơng khảo sát khá giống nhau (bảng 3.4, 3.5, 3.6). Ở các nghiệm thức đối chứng không bổ sung BA, tất cả mẫu đều không tạo chồi, một số mẫu hình thành rễ. Trên