III.1. Thu mẫu và các thông tin có liên quan:
III.1.1. Thu mẫu:
- Thu mẫu tôm bố mẹ: Mẫu tôm sú bố mẹ đã tham gia sinh sản và chưa sinh sản được thu định kỳ hai tuần/ một lần. Mỗi lần thu 04 con tôm mẹ chưa sinh sản, 04 con tôm mẹ đã tham gia sinh sản để đánh giá sự cảm nhiễm virus WSSV, MBV, HPV của chúng.
Trong 7 tháng thực hiện đề tài (từ tháng 01/2007 đến 07/2007), với 14 lần thu mẫu, chúng tôi thu tổng cọng 56 con tôm bố mẹ chưa tham gia sinh sản và 72 con tôm mẹ đã tham gia sinh sản (số mẫu tôm sú mẹ đã tham gia sinh sản thu được nhiều hơn số lượng dự kiến).
- Thu mẫu tôm postlarvae: Mẫu thu ở giai đoạn PL.10. Mẫu được thu ở 5 điểm khác nhau (4 góc và giữa bể) , sau đó trộn lẫn, lấy khoảng 100 con/ bể cho vào bịch nilong có bơm oxy, vận chuyển về phòng thí nghiệm.
III.1.2. Thu thập các thông tin có liên quan đến hiện trạng nghề sản xuất tôm sú giống ở Quảng Nam:
Các số liệu này được lấy từ các báo cáo tổng hợp của Sở Thủy sản, Chi cục Thủy sản, Trung tâm khuyến ngư và phát triển giống thủy sản của tỉnh hàng năm.
III.1.3. Cố định mẫu tôm: Tùy theo phương pháp phân tích mẫu mà cách cố định mẫu khác nhau.
- Các mẫu tôm postlarvae dùng cho kỹ thuật chuẩn đoán nhanh để xác định tỷ lệ và cường độ cảm nhiễm virus MBV thì không cần cố định mà mẫu được chuyển về phòng thí nghiệm có sục khí để đảm bảo postlarvae phải còn sống cho nghiên cứu.
- Tôm bố mẹ dùng cho kỹ thuật mô bệnh học (Histopathology method) được cố định trong dung dịch davidson (Một hỗn hợp gồm: Formol, cồn và axit acetic), tỷ lệ giữa dung dịch cố định và mẫu là 1/10. Thời gian cố định từ
Trang 21
24-36 giờ tùy theo kích thước mẫu lớn hay bé. Các mẫu này cuối cùng được giữ trong cồn etylic 70% cho đến khi cắt mẫu.
- Các mẫu postlarvae và tôm bố mẹ dùng cho phân tích bằng kỹ thuật PCR được cố định trong cồn etylic 95% , tỷ lệ giữa mẫu và cồn là 1/10.
III.2. Các phương pháp nghiên cứu đã áp dụng:
III.2.1. Phương pháp kiểm tra nhanh: với thuốc nhuộm malachite green (MG) để phát hiện các thể ẩn (occlusion body) trong nhân tế bào biểu mô gan tụy của postlarvae.
- Các bước tiến hành: Giải phẩu lấy gan tụy (postlarvae) và nhuộm malachite green 0,1% trong 1 phút, đưa lên quan sát ở kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400X. Các thể ẩn của virus MBV có dạng hình cầu, màu xanh sáng, ít bắt màu thuốc nhuộm so với các vùng mô của gan tụy.
III.2.2. Phương pháp kiểm tra phân tôm bố, mẹ: Bắt tôm bố mẹ ra xô (1con/xô), khi tôm bố, mẹ thải phân ra xô, dùng kẹp gắp lấy một mẫu phân nhỏ đưa lên lam kính. Có thể nhuộm hoặc không nhuộm bằng thuốc nhuộm malachite green 0,1%, đậy lamen và đưa lên kính hiển vi quan sát ở độ phóng đại 400X. Các thể ẩn của virus MBV có dạng hình cầu màu xanh sáng.
III.2.3. Phương pháp đánh dấu tôm mẹ: Đánh số trên giấy, ép plastic các mẫu giấy để tránh bị ngấm nước. Sau đó buộc các số có ép plastic vào đuôi những con tôm mẹ.
III.2.4. Phương pháp mô bệnh học (Histopathology method):
Áp dụng theo phương pháp mô bệnh học ở giáp xác của Lightner (1996). Các bước tiến hành như sau:
- Mẫu đã cố định trong cồn etylic 70% được làm mất nước qua các nồng độ cồn 70%, 95%, 99,6%. Mỗi nồng độ ngâm 1-3 lần, thời gian ngâm là 30 phút/lần. .
- Làm trong mẫu: Chuyển mẫu đã được khử nước sang dung dịch làm trong mẫu bằng cholroroform (CHCL3) trong thời gian 30 phút và lặp lại 2 lần.
- Thấm parapin: Chuyển mẫu đã làm trong vào parapin đun nóng ở nhiệt độ 60oC, thời gian 3 giờ, lặp lại 2 lần.
Trang 22
- Đúc mẫu: Đặt mẫu đã thấm parapin vào khuôn parapin, đổ parapin vào khuôn có chứa mẫu.
- Cắt gọt khối parapin. Dùng máy cắt, cắt khối parapin có chứa mẫu, thành lát cắt có độ dày 5- 6µm. Đưa lát cắt vào nước nóng 45-50oC trong thời gian 1-2 phút. Dùng lam sạch lấy lát cắt ra.
- Sấy khô lam có mẫu trên máy sấy ở nhiệt độ 45oC trong 2-3 giờ. - Nhuộm mẫu: Tiêu bản được nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin. Sau đó gắn tiêu bản bằng lamel và Bomcanada. Mẫu có thể quan sát bằng kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400X. Các thể ẩn MBV bắt màu hồng đỏ của Eosin nằm ở trong các nhân bị phình to của tế bào gan tụy.
Trang 23
Hình 2: Các bước tiến hành của phương pháp mô bệnh học
III.2.5. Phương pháp PCR:
Đây là phương pháp dùng để nhận biết ADN của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm. Áp dụng phương pháp của Lo et al (1996, 1999). Các bước này được thực hiện như sau:
- Tách chiết nucleic axid: Cho mẫu tôm mẹ đã cố định trong cồn etylic 95% vào tube eppendorf 1.7 ml, thêm vào 100µl dung dịch tách chiết (NAOH-SDS) rồi dùng chày nhỏ nghiền nhuyễn. Sau đó cho thêm 500-700µl dung dịch tách chiết, tiếp tục nghiền cho đến khi mẫu được nghiền nhuyễn
Mẫu tôm đã cố định và giữ trong cồn 70%
Làm mất nước mẫu
qua các nồng độ cồn tăng dần
Thấm mẫu trong parapin lỏng ở nhiệt độ 60oC
Cắt mẫu 5- 6µm
Sấy mẫu ở nhiệt độ 45oC trong 2-3 giờ
Đúc mẫu trong parapin tạo thành
các lock chứa mẫu ở trong
Nhuộm mẫu bằng
Hematoxylin và Eoxin
Làm trong mẫu bằng chloroform
Trang 24
hoàn toàn. Sau khi nghiền xong, đậy chặt nắp rồi dùng kim tiêm vô trùng đục thủng một lỗ nhỏ trên nắp tube, giữ lạnh trong ngăn đá để chuyển qua bước tiếp theo.
- Chuyển các ống nghiệm này sang bếp đun cách thủy, đun trong 5-10 phút. Sau đó lấy ra và làm lạnh nhanh các ống nghiệm trong đá với thời gian 3-5 phút.
- Đưa các ống nghiệm trên vào máy ly tâm, và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Sử dụng phần dịch chiết nổi để chạy PCR.
- Tiến hành chạy phản ứng PCR theo bước một: Sử dụng Pipetman hút 2 microlit dịch chiết DNA của mẫu cần phân tích cho vào ống Eppendorf 0,5ml chuyên dùng có chứa sẵn hỗn hợp A (dung dịch chứng âm) và cho một giọt dầu khoáng phủ lên trên dung dịch phản ứng nhằm ngăn chặn sự bốc hơi khi xảy ra phản ứng và hạn chế tối đa khả năng làm nhiễm DNA vào môi trường thao tác khi mở nắp phản ứng, tiếp đến đóng kín nắp ống đặt vào thiết bị khuyết đại và khởi động chương trình khuyếch đại trong thời gian 3giờ 55 phút.
- Qua bước hai: Lấy ống phản ứng ở bước một, sử dụng pipetman hút 3microlit sản phẩm khuyếch đại cho vào ống Eppendorf 0,5ml chuyên dùng có chứa sẵn hỗn hợp B (dung dịch chứng dương), sau đó tiến hành thao tác như bước một. Sản phẩm khuyếch đại lần hai được chạy điện di ngay bằng cách hút 10mcrolit, đem trộn đều với 2microlit dung dịch nạp mẫu TBE 0,5X, rồi hút 10microlit hỗn hợp trên và bơm thật nhẹ nhàng vào giếng trên bản gel, tiếp tục đặt cả vào bồn điện di và đóng nắp bồn, bật công tắc nguồn điện di ở 100V, 500mA trong 40 phút. Di chuyển bản gel lên bàn UV và quan sát đọc kết quả.
Trang 25
Hình 3: Các bước tiến hành của kỹ thuật PCR
III.3. Các phương pháp bố trí nghiệm áp dụng biện pháp ngăn chặn sự lây nhiễm virus từ tôm mẹ sang đàn ấu trùng:
III.3.1. Thí nghiệm kiểm tra virus WSSV trên tôm mẹ bằng phương pháp PCR trước khi đưa vào sinh sản:
Mẫu tôm cần nghiên cứu Thu mô Chạy PCR bước 2 Đọc kết quả Chạy điện di trên bản thạch Cố định mẫu trong etylic 95% Tách chiết AND Chạy PCR bước 1
Trang 26
Hình 4 : Thí nghiệm kiểm tra WSSV trên tôm sú bố mẹ trước khi cho tham gia sinh sản.
03 con tôm mẹ (-) với WSSV
Cho tôm mẹ tham gia sinh sản ở các dụng cụ riêng biệt Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 4 Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 5 Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 6 - Các bể thí nghiệm có chế độ chăm sóc, quản lý giống nhau
-Kiểm tra WSSV (ở giai đoạn postlarvae 10) bằng phương pháp PCR ở mỗi bể ương riêng biệt.
- Kết luận và đề xuất. 03 con tôm mẹ
(+) với WSSV
Cho tôm mẹ tham gia sinh sản ở các dụng cụ riêng biệt Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 1 Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 2 Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 3
Trang 27
III.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm bằng cách kiểm tra thể ẩn MBV trong phân tôm mẹ trước khi đưa vào sinh sản:
Hình 5: Thí nghiệm kiểm tra MBV trong phân tôm mẹ trước khi cho tham gia sinh sản
03 con tôm mẹ có phân tồn tại thể ẩn
MBV
03 con tôm mẹ có phân không chứa
thể ẩn MBV
Cho tôm mẹ tham gia sinh sản ở các dụng cụ riêng biệt
Cho tôm mẹ tham gia sinh sản ở các dụng cụ riêng biệt Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 1 Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 2 Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 3 Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 4 Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 5 Ương nauplius nở ra từ trứng của con tôm mẹ số 6 - Các bể thí nghiệm có chế độ chăm sóc, quản lý giống nhau.
- Xác định mức độ nhiễm (tỷ lệ và cường độ nhiễm) của MBV ở giai đoạn postlarvae 10 của mỗi bể ương riêng biệt. - Kết luận và đề xuất.
Trang 28
III.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm rửa nauplius trước khi đưa vào ương nuôi ấu trùng tôm sú:
Hình 6: Thí nghiệm rửa nauplius trước khi đưa vào ương nuôi Tôm mẹ có phân
chứa nhiều thể ẩn của MBV
Cho tôm mẹ tham gia sinh sản và thu
nauplius
Rửa nauplius bằng formalin 150ppm trong 30
giây trước khi chuyển vào bể ương nuôi
Không rửa nauplius bằng formalin. Chuyển nauplius
vào bể ương nuôi.
Bể 1 Bể 2 Bể 3 Bể 4 Bể 5 Bể 6
- Các bể thí nghiệm có chế độ chăm sóc, quản lý giống nhau
- So sánh mức độ cảm nhiễm MBV ở đàn postlarvae.
Trang 29
III.4. Bố trí thí nghiệm để kiểm tra khả năng lây nhiễm virus MBV của các tôm sú đực và cái khi nhốt chung nhau trong một dụng cụ:
Có 06 con tôm mẹ đã được kiểm tra phân. Trong đó có 01 con có tồn tại thể ẩn MBV ở phân (ký hiệu B), 05 con không tồn tại thể ẩn MBV trong phân do chúng thải ra (ký hiệu là K1,K2,K3, D1,D2). Chúng tôi bố trí thí nghiệm như sau:
Hình 7: Thí nghiệm kiểm tra khả năng lây lan MBV theo trục ngang giữa các con tôm bố, mẹ được nuôi chung trong một dụng cụ.
01 tôm mẹ có phân tồn tại thể ẩn MBV
(ký hiệu B)
05 tôm bố, mẹ có phân không tồn tại
thể ẩn MBV (Ký hiệu: K1,K2,K3; D1,D2) Bể thí nghiệm (04 con: B, K1,K2,K3) Bể đối chứng (02 con: D1,D2)
- 02 bể thí nghiệm có chế độ chăm sóc, quản lý giống nhau.
- Thí nghiệm được thực hiện trong 15 ngày (từ 1/10 – 15/10/2008), và được lặp lại 2 lần.
- Kiểm tra phân của các con tôm mẹ hàng ngày.
Trang 30
III.5. Phương pháp xử lý số liệu:
III.5.1. Xác định tỷ lệ cảm nhiễm virus:Theo công thức sau:
A1 X =
A
x 100
Trong đó:
X: Tỷ lệ phần trăm (%) tôm (postlarvae, tôm sú bố, mẹ) bị nhiễm virus.
A: Số mẫu tôm (postlarvae, tôm sú bố, mẹ) được kiểm tra. A1: Số mẫu tôm (postlarvae, tôm sú bố mẹ) bị nhiễm virus .