Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp phân tích
2.3.1. Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử
Nguyên tắc phƣơng pháp phân tích UV - Vis
Đầu tiên metanol phản ứng với chất oxi hóa tạo thành fomandehit. Sau đó fomandehit phản ứng với thuốc thử thích hợp trong môi trƣờng tạo hợp chất có màu. Phức màu này đƣợc đem đo độ hấp thụ quang và biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang theo nồng độ.
Quy trình thực hiện
Trƣớc tiên, các điều kiện thí nghiệm tối ƣu đƣợc khảo sát để xác định nhanh metanol bằng phƣơng pháp UV – Vis. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành với 6 chất : metanol, etanol, fomandehit, axetandehit, axit fomic, axit axetic. Dựa vào độ hấp thụ quang (A) và độ lặp lại để đánh giá tính phù hợp của các điều kiện.
- Lựa chọn thuốc thử tạo phức màu: 2 loại thuốc thử axit chromotroic và purpal đƣợc lựa chọn để thí nghiệm với 6 dung dịch chất chuẩn.
- Khảo sát chất oxi hóa: Chất oxi hóa KMnO4/Na2S2O5 và KIO4 đƣợc khảo sát để lựa chọn chất oxi hóa phù hợp.
- Xác định bƣớc sóng hấp thụ cực đại: sau khi lựa chọn đƣợc thuốc thử và chất oxi hóa, phức màu thu đƣợc từ phản ứng đƣợc xác định cực đại hấp thụ dựa vào phổ UV – Vis trong khoảng 400 – 800nm bằng máy trắc quang UV- VIS 1650 PC của hãng Shimazu (Nhật Bản).
- Ảnh hƣởng của thể tích thuốc thử: thể tích thuốc thử đƣợc thay đổi sao cho phù hợp.
- Ảnh hƣởng của thời gian oxi hóa: sau khi thêm dung dịch KMnO4 vào mẫu, thời gian phản ứng thay đƣợc khảo sát 0-30 phút.
- Ảnh hƣởng của thời quan phản ứng màu: thời gian phản ứng màu đƣợc khảo sát từ 5-30 phút.
2.3.2. Phương pháp thử nhanh metanol
Nguyên tắc phƣơng pháp
Đầu tiên metanol phản ứng với chất oxi hóa KMnO4 tạo thành fomandehit. Sau phản ứng, dung dịch sẽ đƣợc thêm vào để loại hết với KMnO4 dƣ.
Sau đó fomandehit sinh ra phản ứng với axit chromotropic trong môi trƣờng axit mạnh tạo hợp chất có màu tím.
So sánh màu sắc của dung dịch thu đƣợc và bảng màu có thể bán định lƣợng đƣợc nồng độ metanol trong mẫu.
Phƣơng pháp nghiên cứu xây dựng quy trình thử nhanh metanol
Thử nhanh metanol trong rƣợu
Để xây dựng kit thử methanol trên cơ sở phƣơng pháp phân tích trắc quang trong phịng thí nghiệm, các khảo sát lựa chọn loại thuốc thử, bộ thử, hình dáng và dụng cụ thử phù hợp. Do vậy cần khảo sát các điều kiện sau:
- Ảnh hƣởng của nồng độ etanol: lƣợng etanol đƣợc thay đổi từ 0 – 70% w/v với quy trình tối ƣu trong phịng thí nghiệm.
- Ảnh hƣởng của lƣợng chất oxy hóa KMnO4 khi nồng độ etanol thay đổi: lƣợng chất oxi hóa thay đổi từ 0,5 – 4ml đồng thời lƣợng etanol thay đổi tử 0- 70%.
- Ảnh hƣởng của các chất độn trong môi trƣờng etanol 20%: 0,2 g các muối vô cơ sẽ đƣợc thêm vào mẫu trƣớc khi cho thuốc thử để đánh giá màu sắc và độ hấp thụ quang của mẫu trắng rƣợu và mẫu thêm chuẩn.
- Khảo sát thứ tự thêm thuốc thử trong kit thử
- Độ bền màu của test kit metanol trong rƣợu: sau khi đã xác định đƣợc các điều kiện tối ƣu mẫu metanol đƣơc khảo sát độ ổn định màu trong 30 phút.
- Xác định khoảng hoạt động và đánh giá độ chính xác của kit thử metanol trong rƣợu: các mẫu metanol đƣợc chuẩn bị với nồng độ khác nhau sử dụng kit thử để xác định bảng màu và đƣờng chuẩn. Các kit thử sẽ đƣợc đánh giá độ lặp lại, độ tái lặp để xác định giá trị sử dụng.
Xác định nhanh metanol trong huyết tƣơng ngƣời Các yếu tố cần khảo sát gồm:
- Ảnh hƣởng của protein trong huyết tƣơng
- Ảnh hƣởng của lƣợng chất oxy hóa KMnO4 khi thay đổi lƣợng protein: lƣợng huyết tƣơng đƣợc khảo sát thay đổi từ 0 -1,00 ml đồng thời lƣợng
- Ảnh hƣởng của các chất độn trong nền mẫu huyết tƣơng
- Độ bền màu của test kit metanol trong huyết tƣơng: độ ổn định màu đƣợc khảo sát trong 30 phút.
- Xác định khoảng hoạt động và đánh giá độ chính xác của kit thử metanol trong huyết tƣơng ngƣời: các mẫu metanol đƣợc chuẩn bị với nồng độ khác nhau sử dụng kit thử để xác định bảng màu và đƣờng chuẩn. Các kit thử sẽ đƣợc đánh giá độ lặp lại, độ tái lặp để xác định giá trị sử dụng.
2.3.3. Phương pháp định lượng metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa bằng 1H – NMR
2.3.3.1. Quy trình đo mẫu triệt tiêu dung mơi
- Bƣớc 1 : đo một phổ 1H bình thƣờng. Lấy tần số cộng hƣởng của nƣớc làm giá trị O1.
- Bƣớc 2: chạy chƣơng trình đo ZGPR để tối ƣu hoá tần số cộng hƣởng của nƣớc.
- Bƣớc 3: sử dụng giá trị O1 thu đƣợc ở bƣớc hai đƣa vào chƣơng trình xung NOESYGPPR1D.
Các phép đo trên có sẵn trong thƣ viện của chƣơng trình Topspin 3.2 của cơng ty Bruker (bản quyền thuộc về trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà Nội).
2.3.3.2. Phương pháp định lượng theo cơng thức
Trong trƣờng hợp lí tƣởng, hàm lƣợng của chất phân tích X có thể tính tốn trực tiếp từ phổ NMR khi có chất nội chuẩn (IS) bằng cơng thức:
(ct 5) Trong đó: : tỉ lệ diện tích pic giữa chất phân tích X và chất nội chuẩn
N: Số nguyên tử tham gia cộng hƣởng từ (metanol : 3, etanol : 3, axetaldehyd :3, axit fomic: 1, axit axetic : 3, axit maleic : 2)
M : khối lƣợng mol (g/mol)
V: thể tích trộn giữa chất X và chất nội chuẩn (ml)
C : Nồng độ của chất phân tích [X] và chất nội chuẩn (mg/l)
2.3.3.3. Phương pháp định lượng theo đường chuẩn
Chuẩn bị dãy các mẫu đã xử lý protein có nồng độ chất phân tích xác định khác nhau. Các mẫu đƣợc thêm 1 lƣợng chính xác chất nội chuẩn. Sau đó mẫu đƣợc đo phổ 1H – NMR. Nồng độ của chất phân tích sẽ tỉ lệ với tỉ lệ tín hiệu diện tích của chất đó và chất nội chuẩn.
(ct 6) Trong đó:
C: nồng độ chất phân tích (mg/l)
: tỉ lệ diện tích pic giữa chất phân tích X và chất nội chuẩn a, b hệ số của phƣơng trình hồi quy