Cmetanol (mg/l) 7,90 15,80 19,75 39,50 79,0 158 197,5 395 Độ hấp thụ
quang 0,036 0,076 0,095 0,194 0,365 0,723 0,993 1,171 Kết quả khảo sát cho thấy khoảng tuyến tính của phƣơng pháp là: 7,9 – 158 mg/l. Từ đó xây dựng đƣờng chuẩn metanol trong khoảng nồng độ 7,9 – 158 mg/l.
160 140 120 100 80 60 40 20 0 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Cmetanol (ppm) Ab s
Hình 3. 7: Đường chuẩn xác định metanol với thuốc thử axit chromotropic 0,1%
Tra bảng chuẩn t với bậc tự do f= 5, độ tin cậy 95% có t = 2,571, kết hợp với các số liệ từ minitab 16. Phƣơng trình hồi qui đầy đủ của metanol sẽ có dạng :
y = (0,00402 ± 0,00666) + (0,00457 ± 0,0001)x.
Giá trị Pvalue = 0,181> 0,05. Có nghĩa là hệ số a khơng có sự khác nhau có nghĩa với giá trị 0 ở độ tin cậy 95% hay phƣơng pháp không mắc sai số hệ thống. Ngoài ra, hệ số tƣơng quan biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào nồng
độ metanol là tƣơng đối tốt (R2= 0,9997) và giá trị P<0,05 chứng tố x và y có mối quan hệ tuyến tính với nhau.
Giới hạn phát hiện: LOD = mg/l.
Giới hạn định lƣợng: LOQ = mg/l.
3.2. Nghiên cứu chế tạo test kit thử nhanh metanol trong rƣợu
Bệnh nhân ngộ độc metanol thƣờng do hai trƣờng hợp hoặc uống nhầm phải rƣợu pha từ metanol hoặc trong rƣợu uống có lẫn lƣợng lớn metanol. Do đó, cần xây dựng kit thử metanol khi có etanol.
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ etanol
Etanol là thành phần chính trong các loại rƣợu. Với các loại rƣợu vang nồng độ etanol thƣờng vào khoảng 7-14%v/v, rƣợu mùi có nồng độ etanol từ 15-75%v/v. Để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ etanol, chúng tơi tiến hành các thí nghiệm với nồng độ metanol 79 mg/l với các nồng độ etanol khác nhau. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: 1 ml dung dịch mẫu phản ứng với 0,5 ml KMnO4 30 g/l sau 10 phút thêm từ từ dung dịch Na2S2O5 100g/l tới khi dung dịch trong suốt, thêm 5 ml thuốc thử axit chromotropic 0,1% và đọc kết quả sau 20 phút.
Nồng độ Etanol (%v/v)
0 0,25 0,5 1 2 5 10 20 30
Hình 3. 8: Ảnh hưởng của nồng độ etanol
Kết quả trong hình 3.8 cho thấy, với nồng độ etanol <2%v/v không ảnh hƣởng tới màu của dung dịch. Màu dung dịch nhạt dần khi tăng nồng độ của etanol
dịch. Nguyên nhân là do etanol và metanol có tính chất hóa học tƣơng tự nhau. Etanol cũng có phản ứng với KMnO4 trong môi trƣờng axit tạo thành axetandehit, với nồng độ lớn nó phản ứng cạnh tranh với metanol làm cho metanol khơng bị oxy hóa thành fomandehit, dẫn đến mất màu dung dịch. Để giải quyết vấn đề này cần tăng lƣợng chất oxy hóa KMnO4.
3.2.2. Ảnh hưởng của lượng chất oxy hóa KMnO4 – H3PO4
Các dung dịch chuẩn có nồng độ metanol 79mg/l và với nồng độ etanol thay đổi từ 0% - 70% v/v đƣợc chuẩn bị. 1ml các dung dịch chuẩn này sẽ đƣợc thêm vào các ống thủy tinh có nắp sau đó thêm lần lƣợt 0,5 , 1, 2, 3, 4 ml dung dịch KMnO4 30g/l vào trong các ống. sau 10 phút, thêm từ từ dung dịch Na2S2O5 vào cho tới khi dung dịch trong suốt không màu. Thêm từ từ 5ml thuốc thử axit chromotropic 0,1% vào ống nghiệm, sau 20 phút đọc kết quả.
Bảng 3. 3: Ảnh hưởng của thể tích KMnO4 khi thay đổi nồng độ etanol
Nồng độ etanol (%) Thể tích KMnO4 (ml) 0 0,5 1 2 5 10 20 30 40 50 60 70 0,5 +++ +++ +++ +++ ++ + - - - - - - 1 +++ +++ +++ +++ +++ + + + - - - - - 2 + + - - +++ +++ ++ + + - - - 3 - - - - +++ +++ +++ +++ ++ ++ + - 4 - - - - + + + + + + + +
+++: nhìn rất rõ màu + có thể phân biệt đƣợc
++: nhìn rõ - : khơng phân biệt đƣợc
Khi tăng lƣợng chất oxi hóa KMnO4 nồng độ etanol gây ảnh hƣởng cũng tăng lên. Kết quả trên bảng 3.1 có thể thấy, khi tăng lƣợng KMnO4 từ 0,5 ml lên 1
KMnO4 lên dƣờng nhƣ đã giải quyết đƣợc vẫn đề ảnh hƣởng của nồng độ lớn etanol lên kết quá phân tích. Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm lại trái ngƣợc với suy đoán này, khi tiếp tục tăng lƣợng chất oxy hóa , mặc dù cận trên cũng tăng lên, các thí nghiệm với nồng độ etanol thấp lại bị ảnh hƣởng. Nguyên nhân là do quá dƣ thừa lƣợng chất KMnO4, thay vì phản ứng với metanol tạo thành fomandehit thì chất này lại oxi hóa metanol lên axit fomic (không tạo phức màu với thuốc thử axit chromotropic 0,1%).
Để đảm bảo cho các thí nghiệm khơng bị ảnh hƣởng bởi etanol quá lớn và lƣợng KMnO4 quá dƣ, các thí nghiệm tiếp theo sẽ sử dụng 1ml dung dịch KMnO4 30g/l phản ứng với 0,2 ml mẫu.
3.2.3. Xây dựng thành phần kit thử metanol trong rượu
3.2.3.1. Ảnh hưởng của các chất độn
Để tiện sử dụng, bảo quản kit thử trong thời gian dài, thuốc thử nên đƣa về dạng rắn. Theo kết quả khảo sát các điều kiện xác định metanol trong phịng thí nghiệm thì hàm lƣợng thuốc thử sử dụng cho mỗi test là rất nhỏ. Do đó, khi kit thử đƣợc chuyển sang dạng rắn để làm giảm sai số cho quá trình cân, cần sử dụng thêm chất độn để tăng lƣợng cân cho mỗi túi kit. Chất độn phải trơ đối với thuốc thử, H2SO4 và metanol. Do vậy, chúng tôi lựa chọn các muối vô cơ của kim loại kiềm để khảo sát.
Thêm 0,2 g các chất độn vào ống nghiệm chứa mẫu etanol 20% có thêm chuẩn metanol 200 mg/l, mẫu đã đƣợc oxi hóa bằng KMnO4 30 g/l trƣớc khi thêm 5ml thuốc thử axit chromotropic 0,1%. Mẫu trắng là dung dịch etanol 20%v/v. Kết quả thực nghiệm thu đƣợc trong bảng 3.4.
Bảng 3. 4: Độ hấp thụ quang của chất khi thêm các chất độn trong nền etanol
Chất độn Không độn KCl (NH4)2SO4 Na2SO4 NaNO3
Độ hấp thụ quang
Hình 3. 9: Màu của methanol trong nền etanol 20% khi thay đổi chất độn
Để phù hợp với việc chế tạo kit thử và điều kiện, chúng tôi lựa chọn chất độn là (NH4)2SO4 hoặc Na2SO4 để chế tạo kit thử metanol trong rƣợu.
3.2.3.2. Thành phần thuốc thử trong kit thử methanol trong rượu
Trên cơ sở khảo sát hàm lƣợng thuốc thử tối ƣu khi phân tích metanol trong phịng thí nghiệm chúng tơi xây dựng thành phần kit thử gồm 2 thành phần nhƣ sau: Thành phần 1 (dung dịch A) gồm: 10 ml nƣớc và 90 ml H2SO4 đặc đƣợc cho vào cốc chịu nhiệt, khuấy đều. Ta đƣợc 20 kit metanol, với thể tích mỗi kit là 5 ml dung dịch A dùng cho phân tích 1 mẫu.
Thành phần 2 (hỗn hợp rắn B): Cân 0,5 g axit chromotropic, 19,5 g (NH4)2SO4. Tiến hành nghiền nhỏ, trộn đều hỗn hợp trên và bảo quản trong lọ kín 100 gói kit metanol, với lƣợng cân mỗi gói là 0,2g rắn B dùng cho phân tích 1 mẫu.
3.2.4. Ảnh hưởng của thứ tự thêm thuốc thử đến độ hấp thụ quang cuả kít thử metanol trong rượu
Lấy vào các ống nghiệm 0,2 ml mẫu etanol 20% đã đƣợc thêm chuẩn metanol với nồng độ trong khoảng 79 mg/l - 400 mg/l, thêm 1ml KMnO4 30g/l, sau 10 phút thêm Na2S2O5 từ từ tới khi dung dịch trong suốt. thay đổi thứ tự thêm thuốc thử. Lắc đều và định mức tới vạch bằng nƣớc cất trong bình định mức 10ml. Sau 20 phút đem đo độ hấp thụ quang tại bƣớc sóng 570 nm, với mẫu trắng làm dung dịch so sánh.
Trong thí nghiệm sử dụng H2SO4 80% làm dung dịch A, do vậy để đảm bảo an tồn, chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của thứ tự thêm thuốc thử bằng cách, cho lần lƣợt các chất vào dung dịch A. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành bằng cách thêm B vào dung dịch A trƣớc, cho mẫu vào dung dịch A trƣớc, trộn B với mẫu trƣợc. Kết quả đƣợc cho trong bẳng 3.4.
Bảng 3. 5: Ảnh hưởng của thứ tự thêm thuốc thử đến độ hấp thụ quang xác định
C metanol(mg/l) B trƣớc Mẫu trƣớc Trộn trƣớc B với mẫu
79 0,093 0,153 0,235
158 0,188 0,237 0,362
395 0,471 0,538 0,587
790 0,531 0,583 0,741
Ở tất cả các mức nồng độ khi thêm hỗn hợp dung dịch B trộn với mẫu , độ hấp thụ quang đều cao hơn so với khi thêm dung dịch A trƣớc hay thêm B trƣớc vì theo cơ chế phản ứng thì fomandehit tạo phức với axit chromotropic trƣớc sau đó mới phản ứng với H2SO4. Do vậy, trong qui trình xây dựng kit thử ta có thể trộn B với mẫu trƣớc khi thêm vào dung dịch A.
3.2.5. Khảo sát thời gian ổn định màu của phức khi sử dụng kit thử
Lấy 0,2 ml dung dịch chuẩn CH3OH 158 mg/l vào ống nghiệm thêm 1ml KMnO4 sau 10 phút thêm từ từ Na2S2O5 đến khi dung dịch không màu thêm kít thuốc thử vào. Định mức trong bình 10 ml bằng nƣớc cất. Lắc đều và tiến hành đo độ hấp thụ quang theo thời gian ở chế độ đo động học với bƣớc sóng 570 nm trong 30 phút, dung dịch H2SO4 đƣợc sử dụng làm dung dịch so sánh.
0.14 0.15 0.16 0.17 0.18 0.19 0.2 0.21 0 5 10 15 20 25 30 35 Ð ? h ? p t h ? q u a n g Th?i gian (phút)
Hình 3. 10: Độ ổn định màu của phức theo thời gian
Màu của dung dịch tăng dần thèo thời gian, sau 20 phút thì độ hấp thụ quang của dụng dịch gần nhƣ không thay đổi.
3.2.6. Ảnh hưởng của hàm lượng fomandehit trong rượu
Rƣợu tự nấu, rƣợu cơng nghiệp có thể có một hàm lƣợng fomandehit nhất định. Lƣợng chất này có thể ảnh hƣởng tới tới kết quả phân tích. Do vậy chúng tơi tiến hành khảo sát nồng độ ảnh hƣởng của HCHO tới test thử. 0,2 ml mẫu chuẩn HCHO với nồng độ khác nhau trong nền etanol 20% đƣợc cho vào ống nghiệm sau đó thêm 5 ml thuốc thử axit chromotropic 0,1% để 20 phút.
Nồng độ HCHO (mg/l)
774,2 387,1 193,7 96,8 48,4 24,2 12,1 6 0
Hình 3. 11: Ảnh hưởng của nồng độ HCHO tới màu của dung dịch
Kết quả cho thấy với nồng độ HCHO là 6mg/l là có ảnh hƣởng tới kết quả phân tích. Vì vậy, để phân tích mẫu đƣợc chính xác tránh dƣơng tính giả với test thử metanol trong rƣợu cần thêm bƣớc tiến hành xác định nhanh fomandehit trong mẫu rƣợu trƣớc khi thử methanol.
3.2.7. Quy trình và khoảng hoạt động kít thử nhanh metanol trong rượu
3.2.6.1. Chế tạo bộ kít thử metanol trong rượu
A chứa KMnO4 30 g/l B chứa Na2S2O5 100g/l C chứa thuốc thử Me 1, Me 2 dùng để phản ứng TT 1, TT 2 chứa H2SO4 80%
Hình 3. 12: Kít thử methanol trong rượu 3.2.6.2. Quy trình thử metanol trong rượu
Trƣớc tiên, 0,2 ml mẫu rƣợu đƣợc lấy vào 2 ống Me 1 và Me 2.
Ống Me 1 (để thử fomandehit): cho 1 gói thuốc thử C vào ống Me 1, lắc đều. Sau khi tan hết, dung dịch trong ống Me 1 sẽ đƣợc cho sang ống TT 1. Lắc đều và để trong 20 phút.
Ống Me 2 ( để thử metanol): Thêm 20 giọt dung dịch trong lọ A vào, lắc đều và để yên trong 10 phút. sau đó thêm từ từ dung dịch trong lọ B vào tới khi dung dịch trong suốt. Gói thuốc thử C cịn lại đƣợc cho vào ống Me 2 , lắc đều. Sau khi tan hết, dung dịch trong ống sẽ đƣợc cho sang ống TT 2. Lắc đều và để trong 20 phút.
Hình 3. 13: Quy trình xác định metanol trong rượu
Kết quả:
Nếu ống TT 1 có màu tím và màu của ống TT 1 và ống TT 2 tƣơng tự nhau thì trong mẫu rƣợu có fomandehit.
Nếu ống TT 1 và ống TT 2 đều có màu tím và màu của ống TT 2 có màu đậm hơn ở ống TT 1 thì trong mẫu rƣợu có fomandehit và metanol.
Nếu ống TT 1 khơng có màu tím và ống TT 2 có xuất hiện màu tím thì trong mẫu rƣợu có metanol.
3.2.6.3. Khoảng hoạt động và bảng màu của kit thử metanol trong rượu
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn metanol nồng độ trong khoảng 50 – 3950 mg/l trong dung dịch etanol 20 %. Thêm 0,2 ml mẫu rƣợu sẽ đƣợc cho vào ống phản
Mẫu Ố n g 1 Ố n g 1 TT 2 Me 1 Me 1 Me 2 Me 2 Me 2 Me 2 Me 2 TT 2 TT 1 TT 1 Me 2 Me 1 C C A B
ứng. Quy trình chuẩn bị nhƣ hình 3.13. Mẫu sau đó đƣợc định mức lên 10 ml rồi đem đo quang.
Bảng 3. 6: Độ hấp thụ quang của metanol trong nền mẫu rượu
Cmetanol (mg/l) 49,38 98,75 197,5 395 790 1185 1580 Độ hấp thụ
quang
0,032 0,060 0,124 0,237 0,453 0,634 0,688 Kết quả khảo sát cho thấy khoảng tuyến tính của phƣơng pháp là: 50 – 1185 mg/l. Từ đó xây dựng đƣờng chuẩn metanol trong khoảng nồng độ 50 – 1185mg/l.
1200 1000 800 600 400 200 0 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Nồng độ metanol (ppm) Đ ộ hấ p th ụ qu an g
Hình 3. 14: Đường chuẩn metanol trong nền mẫu rượu 20%
Phƣơng trình đƣờng chuẩn: y= (0,0148 ± 0,021) + (0,0005 ± 0,00002)x Kết quả phân tích thống kê trên phần mềm minitab 16 cho thấy giá trị Pvalue>0.05 chứng tỏ hệ số a và số 0 khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê hay phƣơng pháp không mắc sai số hệ thống. Giá trị P <0 và giá trị R-Sq = 99,7% chứng tỏ x và y có quan hệ tuyến tính với nhau. Hay độ hấp thụ quang tỉ lệ tuyến tính với nồng độ metanol ở độ tin cậy 95%.
LOD đƣợc xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng. Để xác định LOD chúng tôi tiến hành đo độ hấp thụ quang của mẫu trắng .
Bảng 3. 7: Độ hấp thụ quang của mẫu trắng khi xác định metanol trong rượu
STT 1 2 3 4 5 6 7
Abs 0,001 0,002 0,001 0,004 0,002 0,001 0,003 Từ kết quả trên ta tính đƣợc Sblank = 0,001155
Giới hạn phát hiện: LOD = 7mg/l Giới hạn định lƣợng: LOQ = 23,3mg/l Nồng độ metanol (mg/l) 3950 1975 1580 1185 790 395 200 100 50 Etanol 20% Hình 3. 15: Bảng màu bán định lượng metanol trong rượu
Bảng màu phân tích bán định lƣợng metanol trong rƣợu. bằng mắt thƣờng có thể thấy sự khác biệt cỡ 50 mg/l metanol trong nền mẫu etanol 20 %. Với nồng độ >1185mg/l khơng có sự khác biệt về màu.
Nếu so màu bằng mắt thƣờng có thể phát hiện rƣợu dƣơng tính metanol khi nồng độ methanol trên 50mg/l. So với tiêu chuẩn của bộ y tế về rƣợu uống (methanol>100mg/l), kit thử đáp ứng đƣợc nhu cầu.
3.2.7. Đánh giá độ chính xác khi dùng kit thử metanol trong rượu
a. Độ lặp lại
Độ chụm lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác nhận bằng cách đo tái lặp 3 mức nồng độ độ 100, 395 và 790mg/l trong cùng 1 ngày. Mỗi mẫu tiến hành 5 lần độ lặp lại đƣợc đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tƣơng đối.
Bảng 3. 8: Độ chụm của phương pháp xác định metanol trong mẫu etanol
Nồng độ(mg/l) A1 A2 A3 A4 A5 RSD (%)
100 0,06 0,062 0,066 0,067 0,062 4,7
395 0,234 0,238 0,244 0,234 0,236 1,7 790 0,453 0,457 0,462 0,458 0,465 1,0 Các giá trị RSD%<5% cho thấy phƣơng pháp có độ lặp lại tốt.
b. Độ tái lặp lại
Trong nghiên cứu này, độ chụm tái lặp lại đƣợc xác định bằng cách đo tại 3 ngày khác nhau tại nồng độ 395mg/l.
Bảng 3. 9: Đánh giá độ tái lặp xác định metanol trong nền etanol 20%
Lần Ngày 1 [ Độ hấp thụ quang] Ngày 2 [ Độ hấp thụ quang] Ngày 3 [ Độ hấp thụ quang] 1 0,234 0,247 0,230 2 0,238 0,234 0,247 3 0,244 0,237 0,242 4 0,234 0,246 0,234 5 0,236 0,250 0,234
Từ số liệu ở trên sử dụng chuẩn t so sánh các giá trị trung bình và Minitab 16 thì cho kết quả các giá trị Pvalue > 0,05 hay giá trị ttính < tbảng. Nhƣ vậy các giá trị độ
hấp thụ quang trung của mẫu etanol 20% thêm chuẩn methanol 395mg/l qua các ngày khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê.
c. Độ đúng
Độ đúng của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng cách thử nghiệm trên 3 mẫu rƣợu đƣợc thêm chuẩn với 3 nồng độ. Phƣơng pháp thử nhanh bằng kit thử đƣợc xác định bằng mắt thƣờng so với bảng màu và xác định bằng phƣơng pháp UV –