Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu xác định nhanh methanol bằng phƣơng pháp (UV-Vis)
3.1.1.2. Lựa chọn chất oxy hóa
Metanol khơng có phản ứng với thuốc thử axit chromotropic 0,1% để tạo màu, để có thể nhận biệt đƣợc cần phải oxy hóa metanol thành fomandehit. Với điều kiện phịng thí nghiệm, KMnO4 và KIO4 đƣợc sử dụng làm chất oxy hóa metanol. Qua tham khảo tài liệu [12],[ 51], 0,2 ml dung dịch KIO4 16 mmol/l đƣợc thêm vào 4 ống nghiệm chứa 2 ml dung dịch chất chuẩn là metanol, etanol, fomandehit và axetandehit với nồng độ mỗi chất là 50 mg/l, sau 10 phút để trong bóng tối, thêm từ từ 7ml thuốc thử axit chromotropic 0,1% vào các ống nghiệm trên. Tƣơng tự nhƣ vậy, thêm 1ml KMnO4 30g/l đƣợc thêm vào 4 ống nghiệm chứa 2 ml dung dịch chất chuẩn 50mg/l, sau 15 phút thêm từ từ 0,8 ml Na2S2O5 100g/l tới khi dung dịch khơng màu, sau đó thêm từ từ 7ml thuốc thử axit chromotropic 0,1%. Sau 5 phút quan sát màu bằng mắt thƣờng (hình 3.2).
KIO4
KMnO4/ Na2S2O5
Chất phân tích Nƣớc CH3OH C2H5OH HCHO CH3CHO
Chất oxy hóa KIO4 khơng hiệu quả trong quy trình này vì chỉ có ống nghiệm chứa HCHO cho màu tím đậm với thuốc thử cịn các chất khác cho dung dịch có màu vàng giống với màu của mẫu trắng (nƣớc). Do đó, khơng thể sử dụng chất này để oxy hóa metanol. Mặt khác, thuốc tím lại hiệu quả hơn, màu tím xuất hiện trong 2 ống chứa metanol và fomandehit, điều này chứng tỏ KMnO4 chỉ oxy hóa metanol thành fomandehit và khơng bị oxy hóa thành fomic acid. Vì vậy chúng tơi chọn tác nhân oxy hóa là KMnO4 30g/l cho các thí nghiệm sau.
3.1.1.3. Xác định bước sóng hấp thụ cực đại
Lần lƣợt thêm 1 ml các dung dịch chuẩn metanol với nồng độ tƣơng ứng là 5mg/l, 10mg/l, 20mg/l, 40mg/l, 79mg/l vào trong 5 ống. Sau đó, thêm 0,5 ml dung dịch KMnO4 30 g/l vào mỗi ống, sau 15 phút thêm từ từ dung dịch Na2S2O5 100g/l vào tới khi dung dịch trong suốt không màu. Thêm tiếp từ từ 5ml dung dịch thuốc thử axit chromotropic 0,1% vào mỗi ống, sau 20 phút thì làm nguội rồi định mức tới 10ml bằng nƣớc cất. Dung dịch thu đƣợc đem đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 500 – 700 nm.
Hình 3. 3: Độ hấp thụ quang dung dịch phức màu tại các nồng độ metanol khác nhau
Hình 3.3 cho thấy, bƣớc sóng hấp thụ cực đại của 5 đƣờng cong hấp thụ đều tại 570nm. Do đó, 570nm đƣợc chọn để xác định metanol.
3.1.1.4. Ảnh hưởng của lượng dung dịch axit chromotropic 0,1% lên độ hấp thụ quang
Lần lƣợt thêm 1 ml dung dịch chuẩn metanol với nồng độ 79 mg/l vào trong 6 ống khác nhau. Sau đó, thêm 0,5 ml dung dịch KMnO4 30g/l vào mỗi ống, sau 15 phút thêm từ từ dung dịch Na2S2O5 100g/l vào tới khi dung dịch trong suốt không màu. Thêm từ từ 3, 4, 4,5, 5, 5,5, 6 ml dung dịch thuốc thử axit chromotropic 0,1% lần lƣợt vào mỗi ống, sau 20 phút làm nguội rồi định mức tới 10ml bằng nƣớc cất. Độ hấp thụ quang của dung dịch đƣợc đo tại bƣớc sóng λ = 570nm. Kết quả thu đƣợc ở hình 3.4.
Hình 3. 4: Độ hấp thụ quang phụ thuộc vào thể tích thuốc thử axit chromotropic 0,1%
Nhƣ có thể thấy trên hình 3.4, độ hấp thụ quang tăng khi thể tích của dung dịch thuốc thử axit chromotropic 0,1% từ 3ml lên 5 ml và gần nhƣ khơng thay đổi khi thể tích dung dịch thuốc thử axit chromotropic 0,1% lớn hơn 5ml. Vì vậy, chúng tơi lựa chọn thể tích thuốc thử axit chromotropic 0,1% là 5ml trong thí nghiệm với bình định mức 10 ml cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.1.5. Xác định thời gian oxi hóa metanol
Lần lƣợt thêm 1 ml dung dịch chuẩn metanol với nồng độ 79 mg/l vào trong 6 ống khác nhau. Sau đó, thêm 0,5 ml dung dịch KMnO4 30g/l vào mỗi ống nghiệm. Thời giản phản ứng đƣợc thay đổi từ 0-30 phút, sau đó thêm từ từ dung dịch Na2S2O5 100g/l vào tới khi dung dịch trong suốt không màu. Thêm từ từ 5ml thuốc thử axit chromotropic 0,1%, sau 20 phút làm nguội rồi định mức tới 10ml bằng nƣớc cất. Độ hấp thụ quang đƣợc đo tại bƣớc sóng λ = 570nm.
Bảng 3. 1: Độ hấp thụ quang của phức màu khi thời gian oxi hóa metanol thay đổi
Thời gian
(phút) 0 5 10 15 20 25 30
Độ hấp thụ
quang 0,265 0,275 0,289 0,283 0,286 0,283 0,285
Hình 3. 5: Ảnh hưởng của thời gian oxi hóa đến độ hấp thụ quang phức màu
Thời gian oxy hóa thay đổi từ 0-30 phút, độ hấp thụ quang của sản phẩm thay đổi từ 0,265 – 0,291. Tại 10 phút độ hấp thụ quang là cao nhất. Do vậy thời gian oxy hóa là 10 phút đƣợc chọn cho các phản ứng tiếp theo
3.1.1.6. Xác định thời gian tạo phức màu
Thêm 1 ml dung dịch chuẩn metanol với nồng độ 79 mg/l vào trong 6 ống, thêm tiếp vào mỗi ống 0,5 ml dung dịch KMnO4 30g/l, sau 10 phút thêm từ từ dung dịch Na2S2O5 100g/l vào tới khi dung dịch trong suốt không màu. 5ml dung dịch
gian 5, 10, 15, 20, 25, 30 phút làm nguội các dung dịch phản ứng về nhiệt độ phòng, định mức tới 10 ml. Độ hấp thụ quang đƣợc đo tại bƣớc sóng λ = 570nm. Kết quả thu đƣợc tại hình 3.6.
Hình 3. 6:Ảnh hưởng của thời gian tới độ hấp thụ quang
Kết quả phân tích cho thấy, độ hấp thụ quang tăng lên thì thời gian phản ứng màu tăng lên tới 20 phút và khơng thay đổi khi tăng thời gian lên. Vì vậy, 20 phút là đƣợc chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Từ các thí nghiệm khảo sát điều kiện tối ƣu đã khảo sát, quy trình xác định metanol tối ƣu trong bình 10 ml là: 1ml mẫu phản ứng với 0,5 ml dung dịch KMnO4 sau 10 phút thêm từ từ dung dịch Na2S2O5 tới khi dung dịch không màu, thêm 5ml thuốc thử axit chromotropic 0,1%, sau 20 phút đo độ đem đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 570 nm, với mẫu trắng làm dung dịch so sánh.
3.1.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn xác định metanol bằng phương pháp đo quang trong phịng thí nghiệm
Xây dựng đƣờng chuẩn
Chuẩn bị các bình định mức 8 ml với nồng độ metanol trong khoảng 0-395 mg/l đƣợc tiến hành thí nghiệm với các điều kiện tối ƣu nhƣ đã đƣợc khảo sát. Lấy 1 ml mỗi dung dịch chuẩn cho các ống nghiệm khác nhau, thêm 0,5 ml dung dịch
KMnO4 30 g/l vào mỗi ống, sau 10 phút thêm từ từ dung dịch Na2S2O5 100g/l vào tới khi dung dịch trong suốt, thêm từ từ 5ml dung dịch thuốc thử axit chromotropic 0,1% vào mỗi ống. Sau 20 phút, định mức 10 ml bằng nƣớc cất, dung dịch thu đƣợc đem đo độ hấp thụ quang tại bƣớc sóng 570nm.
Bảng 3. 2 : Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào nồng độ metanol
Cmetanol (mg/l) 7,90 15,80 19,75 39,50 79,0 158 197,5 395 Độ hấp thụ
quang 0,036 0,076 0,095 0,194 0,365 0,723 0,993 1,171 Kết quả khảo sát cho thấy khoảng tuyến tính của phƣơng pháp là: 7,9 – 158 mg/l. Từ đó xây dựng đƣờng chuẩn metanol trong khoảng nồng độ 7,9 – 158 mg/l.
160 140 120 100 80 60 40 20 0 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Cmetanol (ppm) Ab s
Hình 3. 7: Đường chuẩn xác định metanol với thuốc thử axit chromotropic 0,1%
Tra bảng chuẩn t với bậc tự do f= 5, độ tin cậy 95% có t = 2,571, kết hợp với các số liệ từ minitab 16. Phƣơng trình hồi qui đầy đủ của metanol sẽ có dạng :
y = (0,00402 ± 0,00666) + (0,00457 ± 0,0001)x.
Giá trị Pvalue = 0,181> 0,05. Có nghĩa là hệ số a khơng có sự khác nhau có nghĩa với giá trị 0 ở độ tin cậy 95% hay phƣơng pháp không mắc sai số hệ thống. Ngoài ra, hệ số tƣơng quan biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào nồng
độ metanol là tƣơng đối tốt (R2= 0,9997) và giá trị P<0,05 chứng tố x và y có mối quan hệ tuyến tính với nhau.
Giới hạn phát hiện: LOD = mg/l.
Giới hạn định lƣợng: LOQ = mg/l.
3.2. Nghiên cứu chế tạo test kit thử nhanh metanol trong rƣợu
Bệnh nhân ngộ độc metanol thƣờng do hai trƣờng hợp hoặc uống nhầm phải rƣợu pha từ metanol hoặc trong rƣợu uống có lẫn lƣợng lớn metanol. Do đó, cần xây dựng kit thử metanol khi có etanol.
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ etanol
Etanol là thành phần chính trong các loại rƣợu. Với các loại rƣợu vang nồng độ etanol thƣờng vào khoảng 7-14%v/v, rƣợu mùi có nồng độ etanol từ 15-75%v/v. Để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ etanol, chúng tơi tiến hành các thí nghiệm với nồng độ metanol 79 mg/l với các nồng độ etanol khác nhau. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: 1 ml dung dịch mẫu phản ứng với 0,5 ml KMnO4 30 g/l sau 10 phút thêm từ từ dung dịch Na2S2O5 100g/l tới khi dung dịch trong suốt, thêm 5 ml thuốc thử axit chromotropic 0,1% và đọc kết quả sau 20 phút.
Nồng độ Etanol (%v/v)
0 0,25 0,5 1 2 5 10 20 30
Hình 3. 8: Ảnh hưởng của nồng độ etanol
Kết quả trong hình 3.8 cho thấy, với nồng độ etanol <2%v/v không ảnh hƣởng tới màu của dung dịch. Màu dung dịch nhạt dần khi tăng nồng độ của etanol
dịch. Nguyên nhân là do etanol và metanol có tính chất hóa học tƣơng tự nhau. Etanol cũng có phản ứng với KMnO4 trong mơi trƣờng axit tạo thành axetandehit, với nồng độ lớn nó phản ứng cạnh tranh với metanol làm cho metanol khơng bị oxy hóa thành fomandehit, dẫn đến mất màu dung dịch. Để giải quyết vấn đề này cần tăng lƣợng chất oxy hóa KMnO4.
3.2.2. Ảnh hưởng của lượng chất oxy hóa KMnO4 – H3PO4
Các dung dịch chuẩn có nồng độ metanol 79mg/l và với nồng độ etanol thay đổi từ 0% - 70% v/v đƣợc chuẩn bị. 1ml các dung dịch chuẩn này sẽ đƣợc thêm vào các ống thủy tinh có nắp sau đó thêm lần lƣợt 0,5 , 1, 2, 3, 4 ml dung dịch KMnO4 30g/l vào trong các ống. sau 10 phút, thêm từ từ dung dịch Na2S2O5 vào cho tới khi dung dịch trong suốt không màu. Thêm từ từ 5ml thuốc thử axit chromotropic 0,1% vào ống nghiệm, sau 20 phút đọc kết quả.
Bảng 3. 3: Ảnh hưởng của thể tích KMnO4 khi thay đổi nồng độ etanol
Nồng độ etanol (%) Thể tích KMnO4 (ml) 0 0,5 1 2 5 10 20 30 40 50 60 70 0,5 +++ +++ +++ +++ ++ + - - - - - - 1 +++ +++ +++ +++ +++ + + + - - - - - 2 + + - - +++ +++ ++ + + - - - 3 - - - - +++ +++ +++ +++ ++ ++ + - 4 - - - - + + + + + + + +
+++: nhìn rất rõ màu + có thể phân biệt đƣợc
++: nhìn rõ - : khơng phân biệt đƣợc
Khi tăng lƣợng chất oxi hóa KMnO4 nồng độ etanol gây ảnh hƣởng cũng tăng lên. Kết quả trên bảng 3.1 có thể thấy, khi tăng lƣợng KMnO4 từ 0,5 ml lên 1
KMnO4 lên dƣờng nhƣ đã giải quyết đƣợc vẫn đề ảnh hƣởng của nồng độ lớn etanol lên kết quá phân tích. Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm lại trái ngƣợc với suy đoán này, khi tiếp tục tăng lƣợng chất oxy hóa , mặc dù cận trên cũng tăng lên, các thí nghiệm với nồng độ etanol thấp lại bị ảnh hƣởng. Nguyên nhân là do quá dƣ thừa lƣợng chất KMnO4, thay vì phản ứng với metanol tạo thành fomandehit thì chất này lại oxi hóa metanol lên axit fomic (không tạo phức màu với thuốc thử axit chromotropic 0,1%).
Để đảm bảo cho các thí nghiệm khơng bị ảnh hƣởng bởi etanol quá lớn và lƣợng KMnO4 quá dƣ, các thí nghiệm tiếp theo sẽ sử dụng 1ml dung dịch KMnO4 30g/l phản ứng với 0,2 ml mẫu.
3.2.3. Xây dựng thành phần kit thử metanol trong rượu
3.2.3.1. Ảnh hưởng của các chất độn
Để tiện sử dụng, bảo quản kit thử trong thời gian dài, thuốc thử nên đƣa về dạng rắn. Theo kết quả khảo sát các điều kiện xác định metanol trong phịng thí nghiệm thì hàm lƣợng thuốc thử sử dụng cho mỗi test là rất nhỏ. Do đó, khi kit thử đƣợc chuyển sang dạng rắn để làm giảm sai số cho quá trình cân, cần sử dụng thêm chất độn để tăng lƣợng cân cho mỗi túi kit. Chất độn phải trơ đối với thuốc thử, H2SO4 và metanol. Do vậy, chúng tôi lựa chọn các muối vô cơ của kim loại kiềm để khảo sát.
Thêm 0,2 g các chất độn vào ống nghiệm chứa mẫu etanol 20% có thêm chuẩn metanol 200 mg/l, mẫu đã đƣợc oxi hóa bằng KMnO4 30 g/l trƣớc khi thêm 5ml thuốc thử axit chromotropic 0,1%. Mẫu trắng là dung dịch etanol 20%v/v. Kết quả thực nghiệm thu đƣợc trong bảng 3.4.
Bảng 3. 4: Độ hấp thụ quang của chất khi thêm các chất độn trong nền etanol
Chất độn Không độn KCl (NH4)2SO4 Na2SO4 NaNO3
Độ hấp thụ quang
Hình 3. 9: Màu của methanol trong nền etanol 20% khi thay đổi chất độn
Để phù hợp với việc chế tạo kit thử và điều kiện, chúng tôi lựa chọn chất độn là (NH4)2SO4 hoặc Na2SO4 để chế tạo kit thử metanol trong rƣợu.
3.2.3.2. Thành phần thuốc thử trong kit thử methanol trong rượu
Trên cơ sở khảo sát hàm lƣợng thuốc thử tối ƣu khi phân tích metanol trong phịng thí nghiệm chúng tơi xây dựng thành phần kit thử gồm 2 thành phần nhƣ sau: Thành phần 1 (dung dịch A) gồm: 10 ml nƣớc và 90 ml H2SO4 đặc đƣợc cho vào cốc chịu nhiệt, khuấy đều. Ta đƣợc 20 kit metanol, với thể tích mỗi kit là 5 ml dung dịch A dùng cho phân tích 1 mẫu.
Thành phần 2 (hỗn hợp rắn B): Cân 0,5 g axit chromotropic, 19,5 g (NH4)2SO4. Tiến hành nghiền nhỏ, trộn đều hỗn hợp trên và bảo quản trong lọ kín 100 gói kit metanol, với lƣợng cân mỗi gói là 0,2g rắn B dùng cho phân tích 1 mẫu.
3.2.4. Ảnh hưởng của thứ tự thêm thuốc thử đến độ hấp thụ quang cuả kít thử metanol trong rượu
Lấy vào các ống nghiệm 0,2 ml mẫu etanol 20% đã đƣợc thêm chuẩn metanol với nồng độ trong khoảng 79 mg/l - 400 mg/l, thêm 1ml KMnO4 30g/l, sau 10 phút thêm Na2S2O5 từ từ tới khi dung dịch trong suốt. thay đổi thứ tự thêm thuốc thử. Lắc đều và định mức tới vạch bằng nƣớc cất trong bình định mức 10ml. Sau 20 phút đem đo độ hấp thụ quang tại bƣớc sóng 570 nm, với mẫu trắng làm dung dịch so sánh.
Trong thí nghiệm sử dụng H2SO4 80% làm dung dịch A, do vậy để đảm bảo an tồn, chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của thứ tự thêm thuốc thử bằng cách, cho lần lƣợt các chất vào dung dịch A. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành bằng cách thêm B vào dung dịch A trƣớc, cho mẫu vào dung dịch A trƣớc, trộn B với mẫu trƣợc. Kết quả đƣợc cho trong bẳng 3.4.
Bảng 3. 5: Ảnh hưởng của thứ tự thêm thuốc thử đến độ hấp thụ quang xác định
C metanol(mg/l) B trƣớc Mẫu trƣớc Trộn trƣớc B với mẫu
79 0,093 0,153 0,235
158 0,188 0,237 0,362
395 0,471 0,538 0,587
790 0,531 0,583 0,741
Ở tất cả các mức nồng độ khi thêm hỗn hợp dung dịch B trộn với mẫu , độ hấp thụ quang đều cao hơn so với khi thêm dung dịch A trƣớc hay thêm B trƣớc vì theo cơ chế phản ứng thì fomandehit tạo phức với axit chromotropic trƣớc sau đó mới phản ứng với H2SO4. Do vậy, trong qui trình xây dựng kit thử ta có thể trộn B với mẫu trƣớc khi thêm vào dung dịch A.
3.2.5. Khảo sát thời gian ổn định màu của phức khi sử dụng kit thử
Lấy 0,2 ml dung dịch chuẩn CH3OH 158 mg/l vào ống nghiệm thêm 1ml KMnO4 sau 10 phút thêm từ từ Na2S2O5 đến khi dung dịch không màu thêm kít thuốc thử vào. Định mức trong bình 10 ml bằng nƣớc cất. Lắc đều và tiến hành đo độ hấp thụ quang theo thời gian ở chế độ đo động học với bƣớc sóng 570 nm trong 30 phút, dung dịch H2SO4 đƣợc sử dụng làm dung dịch so sánh.
0.14 0.15 0.16 0.17 0.18 0.19 0.2 0.21 0 5 10 15 20 25 30 35 Ð ? h ? p t h ? q u a n g Th?i gian (phút)
Hình 3. 10: Độ ổn định màu của phức theo thời gian
Màu của dung dịch tăng dần thèo thời gian, sau 20 phút thì độ hấp thụ quang của dụng dịch gần nhƣ không thay đổi.