Quá trình xác định nhanh metanol và etanol gồm 2 giai đoạn, giai đoạn 1 là q trình oxy hóa các ancol, q trình 2 là phản ứng nhận biết với thuốc thử. Trƣớc tiên, metanol và etanol bị oxy hóa thành các andehit nhờ các tác nhân oxy hóa.
Trong đó, việc sử dụng các phản ứng có xúc tác là các men sinh học đƣợc các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều do tính chọn lọc cao.
Men ancol dehydrogenase (ADH) xúc tác cho quá trình chuyển ancol thành
andehit trong cơ thể ngƣời với sự có mặt của NicotinamideAdenine Dinucleotide
(NAD). NAD là tác nhân oxy hóa mạnh, bằng việc nhận thêm 1 electron để tạo thành NADH. Phản ứng này đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng trong việc xác định metanol và etanol [9],[ 12].
(1) (2)
Ngoài ra, men ancol oxidase cũng đƣợc sử dụng xúc tác cho phản ứng oxy hóa metanol và etanol trong mơi trƣờng giàu O2 (tác nhân oxy hóa). Phản ứng xảy ra ngay nhiệt độ phịng, trong mơi trƣờng đệm phosphat pH 7.5, sản phẩm thu đƣợc là hydro peroxit và các andehit tƣơng ứng [12],[ 21],[23],[23] . Đây cũng là phản ứng hay đƣợc sử dụng, chuyển hóa hồn tồn các ancol thành andehit.
(3) (4)
Ngoài việc sử dụng các phản ứng có xúc tác là các men sinh học trên thì cũng có thể sử dụng các chất oxi hốc vơ cơ khác nhƣ KMnO4 để oxy hóa ancol [51] [12]. KMnO4 tác dụng với metanol trong mơi trƣờng axit, q trình oxy hóa Mn7+ nhận 5 electron tạo thành Mn2+. Để phản ứng đƣợc xảy ra hoàn toàn cần cho dƣ lƣợng KMnO4 vào dung dịch mẫu thử, phản ứng tại nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó dung dịch natri pyrosulfit đƣợc thêm vào để phản ứng hết với lƣợng thuốc tím cịn dƣ, để đảm bảo dung dịch thu đƣợc trong suốt không màu.
Natri periodat (NaIO4) cũng đƣợc Shin và các cộng sự [12] sử dụng để phản ứng với các ancol. Phản ứng đƣợc thực hiện trong phịng tối ít ánh sáng trong 10 phút. Kết quả cho thấy metanol gần nhƣ không phản ứng với NaIO4, Etanol có phản ứng tuy nhiên hiệu suất phản ứng thấp. NaIO4 phản ứng mạnh với các ancol có 2 nhóm chức OH liền kề nhƣ etylenglycol.
Việc sử dụng các men sinh học trong các phản ứng có rất nhiều ƣu điểm: các phản ứng rất đặc hiệu, chọn lọc với một số chất nhất định, các phản ứng xảy ra ngay lập tức với hiệu xuất rất cao gần nhƣ hoàn toàn. Kết quả là giảm đƣợc thời gian phân tích và độ thu hồi cao. Tuy nhiên, các men sinh học này thƣờng rất đắt và đòi hỏi điều kiện bảo quản phải nghiêm ngặt, do đó việc sử dụng rộng rãi các loại xúc tác này thƣờng hạn chế. Trong khi đó, KMnO4 hay cịn gọi là thuốc tím, là chất oxy hóa rất phổ biến, giá thành thấp, dễ bảo quản, hơn nữa KMnO4 phản ứng với Metanol và Etanol cho hiệu suất phản ứng cao. Do đó, có thể sử dụng KMnO4 làm chất oxy hóa để xác định metanol và etanol.
Sau khi các phản ứng oxy hóa khử xảy ra, các chất trung gian thu đƣợc sẽ phản ứng với các thuốc thử thích hợp thu đƣợc các sản phẩm là hợp chất mang màu. Các nghiên cứu tập trung vào các thuốc thử có thể phản ứng với các andehit đƣợc tạo thành.
Trong nghiên cứu của Shin và các cộng sự [12], nhóm tác giả đã sử dụng 3- methylbenzothiazolon hydrazin (MBTH) làm thuốc thử để nhận biết các ancol trong nƣớc bọt, cho sản phẩm có màu xanh lam. Với việc sử dụng men ADH, MBTH có thể nhận biết đƣợc etanol với giới hạn phát hiện đƣợc là 0,5 mg/dl và ethylen glycol với nồng độ > 200mg/dl. Etanol và metanol có thể nhận biết khi sử dụng men ancol oxidase, phƣơng pháp này nhạy với metanol hơn với LOD là 1mg/dl. Nếu sử dụng natri periodat làm tác nhân oxy hóa, MBTH nhạy với etylen glycol hơn so với etanol, metanol gần nhƣ không phát hiện đƣợc. Etanol, metanol, etylen glycol, và
dietylen glycol đều có thể đƣợc nhận biết nếu sử dụng kali permanganat làm chất oxy hóa. Kết quả cho thấy, độ nhạy của phƣơng pháp với các chất theo thứ tự: metanol > etylen glycol > dietylen glycol > etanol. Tuy nhiên, việc sử dụng MBTH khơng thể khẳng định đƣợc có metanol trong mẫu khi có mặt của etanol.
Trong môi trƣờng bazơ, phloroglucinol phản ứng với fomandehit cho sản phẩm có màu da cam dễ nhận biết [67]. Tuy nhiên, sản phẩm màu không bền, theo thời gian dung dịch bị mất màu do có sự tƣơng tác với phloroglucinol cịn dƣ trong dung dịch. Ngoài ra, khi có mặt axetandehit với nồng độ > 3,5mg/dl trong mẫu, cũng ảnh hƣởng tới cƣờng độ màu của dung dịch.
Thuốc thử purpald cũng đƣợc sử dụng để nhận biết các andehit [45]. Trong môi trƣờng pH 10-11, pulpald phản ứng với hầu hết các andehit thu đƣợc sản phẩm có màu tím đặc trƣng. Do đó khơng nhận biết đƣợc các andehit với nhau. Để có thể nhận biết đƣợc metanol bằng thuốc thử purpald khi có mặt của etanol cần lựa chọn tác nhân oxy hóa phù hợp sao cho etanol khơng bị chuyển về dạng andehit mà chỉ có metanol. Có thể sử dụng men fomandehit dehydrogenas cho phản ứng này.
Axit chromatropic đƣợc khuyến cáo sử dụng để xác định fomandehit [27] [1]. Sản phẩm phức màu tím đặc trƣng đƣợc hình thành khi axit chromotropic phản ứng với fomandehit trong môi trƣờng axit H2SO4. [26],[ 45],[ 51],[63]. Phản ứng xảy ra ngay sau khi thêm thuốc thử vào, khác với thuốc thử purpal cần 5 phút để hiện màu. Phƣơng pháp này rất nhạy với fomandehit, với giới hạn phát hiện là 1mg/l.
Trong nghiên cứu của Bayder và các cộng sự [21] đã xác định đƣợc metanol trong máu chuột bằng cách sử dụng thuốc thử p-iodonitrotetrazolium hydrochloride (p-INT). Thay vì sử dụng thuốc thử để nhận biết fomandehit nhƣ các nghiên cứu khác, nhóm tác giả lại nghiên cứu nhận biết chất trung gian NADH của phản ứng giữa Metanol và NAD+ với xúc tác men formandehite dehydrogenase. Quá trình
nhận biết dựa trên phản ứng giữa NADH và p-INT cho sản phẩm có màu hồng đậm- đỏ dƣới xúc tác của enzym diaphorase. Phƣơng pháp này khơng bị ảnh hƣởng khi có mặt của etanol, do men formandehite dehydrogenase chỉ xúc tác cho phản ứng
oxy hóa metanol thành andehit. Phƣơng pháp này cũng đƣợc sử dụng để làm test thử nhanh etanol trong mẫu nƣớc bọt, với việc sử dụng men ADH thay cho formandehite dehydrogenase. Test kit với tên thƣơng phẩm AlcoRange@
(QEDAISOTM Enzymatics, Horsham, PA) với độ nhạy 100 mg/l. test kit không bị dƣơng tính chéo với metanol hay isopropanol hay etylen glycol[9].
Test kít ALCO-Screen (Craig Medical Distribution, Inc., Vista, CA) xác
định metanol và etanol đƣợc xây dựng dựa trên phản ứng của chúng với oxy dƣới xúc tác của men ancol oxidase sinh ra hydrogen peroxid, chất này phản ứng với 1
thuốc nhuộm đặc hiệu sinh ra hợp chất có màu xanh dƣới tác dụng của men peroxidase. Test kit này đƣợc ứng dụng để xác định metanol và etanol trong nƣớc bọt và máu. Ƣu điểm của phƣơng pháp là nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, giới hạn phát hiện thấp 30 mg/l. Tuy nhiên phƣơng pháp này không thể phân biệt đƣợc etanol và metanol đo cùng đáp ứng [40],[ 44].
Ngoài các phƣơng pháp so màu, các loại sensor điện hóa cũng đƣợc nghiên cứu để xác định nhanh metanol. Một số loại polymer cũng đƣợc sử dụng để làm vật liệu cảm biến hơi metanol nhƣ Poly(2-dodecanoylsulfanyl-p-phenylenevinylene) (12COS-PPV) [48] khoảng tuyến tính 0,05% - 4%, cảm biến polypyrolo – polyvinyl ancol (PPy - PVA) đƣợc Lin và các cộng sự [30] nghiên cứu cải tiến nhạy hơn 9 lần so với cảm biến PPy thƣờng, độ nhạy đạt đƣợc là 15mg/l. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của phƣơng pháp là việc chế tạo sensor tƣơng đối khó, độ bền của cảm biến giảm do thêm PVA (<10h).
Phthalocyanine (Pc) đƣợc gắn thành nhánh hay nhóm chức của chuỗi polysiloxanes, sau đó 1 lớp mỏng hợp chất đƣợc phủ lên bề mặt của vật liệu đế. Nồng độ metanol đo đƣợc trong khoảng 5-200mg/l, tần số 6-10GHz [28].
Tzang và các cộng sự [32] lại sử dụng điện cực glassy cacbon biến tính để
định lƣợng fomat, với 1 lớp màng 3,4-dihyroxybenzandehit (3,4-DHB) phủ bên ngoài điện cực và 1 màng nylon chứa enzym đặc hiệu đƣợc gắn vào đầu điện cực. Nguyên lý của phƣơng pháp là fomat chuyển hóa thành CO2 nhờ xúc tác của enzym
formate dehydrogenase, phản ứng sinh ra NAD+, điện cực glassy cacbon biến tính 3,4-DHB đo thế oxy hóa khử của phản ứng khử NAD+ thành dạng NADH. Phƣơng pháp rất nhanh và đặc hiệu cho việc xác định fomat, nhƣng việc chế tạo điện cực không kinh tế do sử dụng các enzym.
Cũng trên nền điện cực glassy cacbon, Park và các cộng sự [34] lại sử dụng hạt nano platin để bọc điện cực, sau đó 1 lớp silicone epoxy 300nm đƣợc bọc bên ngoài điện cực, sau 12 tiếng điện cực đƣợc sử dụng để định lƣợng metanol. Đầu tiên, metanol hấp phụ trên bề mặt điện cực, lớp silicon có tác dụng làm giảm ảnh hƣởng của sự hấp phụ CO(đƣợc tạo thành trong quá trình phản ứng) lên bề mặt điện cực và làm nhiễm bẩn bề mặt. Pic oxi hóa của metanol xuất hiện ở +0,5V, giới hạn phát hiện 3,2 mg/l
1.2.3. Phương pháp 1H – NMR
1.2.3.1. Nguyên tắc của phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Hạt nhân của mỗi đồng vị của một nguyên tử đƣợc đặc trƣng bởi số lƣợng tử spin L.Số lƣợng tử spin L phụ thuộc vào số proton và số notron.
Bảng 1. 1: Tương quan giữa số lượng tử L và số hạt proton, notron
Proton Chẵn Lẻ Không cùng chẵn
lẻ
Notron Chẵn Lẻ
Số lƣợng tử spin L 0 1, 2, 3 ½ , 3/2, 5/2
Ví dụ 16O 12C 32S 14N 10B 2H 1H 19F 13C
Với L = 0: Hạt nhân khơng có spin thì khơng có momen từ (µ = 0) tức là khơng có từ tính hạt nhân, loại này khơng có hoạt động từ và khơng có cộng hƣởng từ hạt nhân.
Với L ≠ 0: hạt nhân gây ra momen từ (µ≠0), hạt nhân loại này có hoạt động từ và gây ra cộng hƣởng từ hạt nhân.
Khi đặt các hạt nhân từ vào trong từ trƣờng ngồi có từ trƣờng Bo thì các momen từ hạt nhân sẽ xoay theo hƣớng đƣờng sức của từ trƣờng ngoài. Sự xoay hƣớng của các momen từ khơng phải bất kì mà chỉ có một số vị trí nhất định trong khơng gian gọi là sự lƣợng tử hóa.. Điều kiện lƣợng tử hóa đƣợc đặc trƣng bằng số lƣợng tử từ m, có giá trị từ -L , -L+1… , +L.
Khi đặt hạt nhân từ có L= 1/2 vào trong từ trƣờng sẽ xảy ra sự chia thành 2 mức năng lƣợng khác nhau có hiệu số chênh lệch là :
(ct 2)
Kết luận: Để có đƣợc phổ cộng hƣởng từ hạt nhân ta cần đặt mẫu nghiên cứu vào một từ trƣờng mạnh, có cƣờng độ Bo và tác dụng lên mẫu một sóng vơ tuyến có tần số ν thỏa mãn phƣơng trình trên.
1.2.3.2. Sơ đồ khối nguyên tắc hoạt động
Sơ đồ khối về nguyên tắc hoạt động của máy NMR đƣợc thể hiện trên hình 1.2. Mẫu hợp chấy hữu cơ đƣợc hịa tan trong dung mơi thích hợp (CDCl3, khoảng 0,5 ml), dung dịch này đƣợc đặt vào ống thủy tinh có đƣờng kính 5mm dài 20 cm. Ống này đƣợc đặt thẳng đứng , giữa 2 cực nam châm, sao cho từ trƣờng đi qua ống, và quay quanh trục với vận tốc khoảng 30 vòng/giây. Từ trƣờng của nam châm (B0) sẽ khiến cho các hạt nhân 1H hoặc 13C định hƣớng song song cùng chiều hoặc song song ngƣợc chiều với hƣớng từ trƣờng của nam châm. Sau đó mẫu chất đƣợc chiếu xạ bởi năng lƣợng của sóng radio. Dƣới tác dụng của tần số bức xạ không đổi, mỗi hạt nhân sẽ cộng hƣởng tại 1 lực từ trƣờng khác nhau, khi thay đổi từ trƣờng áp dụng. Bộ phận ghi nhận tín hiệu ghi lại sự hấp thu năng lƣợng sóng radio của mẫu và chuyển thành phổ NMR.