CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
2.3 Phƣơng phỏp nghiờn cứu
2.3.1 Chiết xuất, phõn lập flavonoid chớnh
► Chiết xuất: Để chiết đƣợc nhúm chất chứa trong đối tƣợng nghiờn cứu, phải xõy dựng đƣợc cỏc quy trỡnh chiết xuất thớch hợp. Tựy theo tớnh chất của mỗi chất mà sử dụng dung mơi cú độ phõn cực khỏc nhau. Khảo sỏt sự ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quỏ trỡnh chiết xuất (chiết nguội, chiết núng) để đảm bảo hợp lý cả hai yờu cầu: Chiết đƣợc tối đa lƣợng chất nghiờn cứu và tối thiểu tạp chất để thuõn tiện cho quỏ trỡnh phõp và tinh chế tiếp theo [21].
Đối với hợp chất flavonoid: Sử dụng phƣơng phỏp ngõm lạnh hoặc chiết núng với ethanol ở cỏc độ cồn khỏc nhau.
Chiết dƣợc liệu (nụ vối) với dung mơi là ethanol 96%, sau đú đem cất cơ quay để thu hồi dung mụi, ta thu đƣợc cắn tổng. Hũa tan cắn tổng với lƣợng nƣớc thớch hợp rồi chiết từng phõn đoạn với dung mơi cú độ phõn cực tăng dần:
n-hexan, ethyl acetat, n-butanol ta thu đƣợc cỏc phõn đoạn cắn khỏc nhau.
►Phõn lập: Sử dụng sắc ký cột với cỏc loại pha tĩnh hấp phụ (silica gel), phõn bố pha đảo (C18), thấm qua gel (Sephadex LH-20). Tựy theo từng chất mà chọn pha tĩnh thớch hợp hoặc phải kết hợp sử dụng cỏc pha tĩnh khỏc nhau. Khảo sỏt lựa chọn dung mụi rửa giải bằng TLC [47].
Phõn lập flavonoid chớnh trong nụ vối bằng phƣơng phỏp sắc ký cột (Column Chromatography): pha tĩnh là silica gel, cỡ hạt 40-63 àm (Merck), pha động là hệ dung mơi hữu cơ cú độ phõn cực khỏc nhau (n-hexan, diclomethan, ethyl acetat, aceton, methanol…).
2.3.2 Xỏc định cấu trỳc chất phõn lập
Kiểm tra độ tinh khiết bằng phƣơng phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, xỏc định cấu trỳc chất phõn lập thơng qua phõn tớch tớnh chất húa lý (cảm quan, nhiệt độ núng chảy, năng suất quay cực) kết hợp với việc phõn tớch cỏc phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn (1H-NMR và 13C-NMR), khối phổ (MS) và so sỏnh với dữ liệu trong cỏc tài liệu tham khảo.
2.4 Xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh flavonoid trong nụ và lỏ vối 2.4.1 Định tớnh bằng phƣơng phỏp húa học
Định tớnh flavonoid chớnh bằng cỏc phản ứng húa học thơng thƣờng [6]. + Phản ứng với hơi amoniac.
+ Phản ứng cyanidin. + Phản ứng với FeCl3 5%. + Phản ứng với kiềm loóng.
2.4.2 Định tớnh bằng phƣơng phỏp sắc ký
Dựng cỏc phƣơng phỏp sắc ký: Sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định tớnh nhúm chất flavonoid trong nụ và lỏ vối.
a. Định tớnh bằng TLC
Khảo sỏt điều kiện phõn tớch định tớnh phự hợp ỏp dụng cho nhúm chất flavonoid trong nụ và lỏ vối, gồm cú cỏc yếu tố liờn quan nhƣ: Cỏch xử lý mẫu, pha tĩnh, pha động, cỏch phỏt hiện…
Xử lý mẫu (chuẩn bị mẫu chấm sắc ký):
Một trong những ƣu điểm của kỹ thuật TLC là loại sắc ký mở, cú pha tĩnh là cỏc bản mỏng chỉ dựng một lần. Do vậy, việc xử lý mẫu khơng địi hỏi khắt khe nhƣ cỏc loại sắc ký cột khỏc. Cú thể tiến hành bằng phƣơng phỏp siờu õm (sonicating) hoặc phƣơng phỏp chiết hồi lƣu trờn cỏch thủy với dung mơi thớch hợp. Dung mụi methanol đó đƣợc ỏp dụng phổ biến để chiết với đa số cỏc thành phần hoạt chất. Tuy nhiờn, trong một số trƣờng hợp cần thiết ta cú thể ỏp
dụng chiết với cỏc dung mụi khỏc, với mục đớch làm giàu thành phần nhúm chất, hoạt chất cần phõn tớch và loại bớt tạp chất gõy cản trở cho việc tỏch và phỏt hiện nhúm chất, hoạt chất đú.
Pha tĩnh:
Là bản mỏng silica gel GF254. Trƣớc khi sử dụng, bản mỏng đƣợc sấy ở 105 – 1100C khoảng 30 phỳt, để nguội đến nhiệt độ phũng.
Pha động:
Tiến hành khảo sỏt lựa chọn hệ dung mụi sắc ký phự hợp ỏp dụng cho việc tỏch thành phần nhúm chất flavonoid trong nụ và lỏ vối. Tiến hành khảo sỏt dựa trờn cơ sở tham khảo từ tài liệu về cỏc hệ dung mụi đó đƣợc ỏp dụng tỏch nhúm chất flavonoid. Ta cú thể điều chỉnh, thay đổi tỷ lệ hoặc thành phần dung mụi cho phự hợp. Bờn cạnh đú, tiến hành khảo sỏt cú dựa trờn cơ sở tham khảo tớnh chất phõn cực (cú ảnh hƣởng đến giỏ trị Rf của chất phõn tớch) và tớnh lựa chọn của mỗi loại dung mơi (cú ảnh hƣởng đến sự thay đổi vị trớ của cỏc vết trờn sắc ký đồ) để lựa chọn.
Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng gần nhƣ thẳng đứng với bỡnh triển khai,
cỏc vết chấm phải ở trờn bề mặt của lớp dung mụi khai triển (cỏch khoảng 5 mm). Đậy kớn bỡnh để ngun ở nhiệt độ thƣờng, khụng đổi. Khi dung mụi đó triển khai trờn bản mỏng đƣợc một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bỡnh, đỏnh dấu mức dung mụi, làm bay hơi dung mơi cịn đọng lại trờn bản mỏng rồi hiện vết bằng cỏch phun thuốc thử.
Kết quả là cỏc sắc ký đồ TLC của flavonoid chớnh cú giỏ trị hệ số di chuyển Rf (đƣợc tớnh bằng tỉ số giữa quóng đƣờng đi đƣợc của chất cần phõn tớch và quóng đƣờng pha động đi đƣợc)
HPLC đƣợc sử dụng kết hợp với TLC để kiểm tra sự cú mặt của hợp chất là đối tƣợng nghiờn cứu ngay từ khõu định tớnh dƣợc liệu và trong quỏ trỡnh chiết xuất bằng cỏch so sỏnh thời gian lƣu tR, phổ sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu đối chiếu [1, 2].
2.5 Xõy dựng phƣơng phỏp định lƣợng flavonoid trong nụ và lỏ vối 2.5.1 Định lƣợng flavonoid toàn phần bằng phƣơng phỏp trắc quang 2.5.1 Định lƣợng flavonoid toàn phần bằng phƣơng phỏp trắc quang
Định lƣợng toàn phần flavonoid trong nụ và lỏ vối bằng phƣơng phỏp tắc quang: Thực hiện dựa trờn phản ứng của flavonoid với AlCl3 sẽ tạo phức màu hồng cú độ hấp thụ ỏnh sỏng cực đại ở bƣớc súng 510 nm. Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bƣớc súng 510 nm rồi tớnh ra hàm lƣợng flavonoid (tớnh theo chất chuẩn CO-1 và catechin) tƣơng đƣơng với mẫu chuẩn làm cựng điều kiện.
Khảo sỏt lựa chọn dung mơi thớch hợp trong việc định lƣợng flavonoid toàn phần.
Dựa trờn phản ứng tạo phức của flavonoid với thuốc thử tạo màu trong việc lựa chọn bƣớc súng xỏc định.
Xõy dựng phƣơng phỏp phõn tớch theo cỏc chỉ tiờu: + Tớnh đặc hiệu
+ Độ lặp lại + Độ đỳng
+ khoảng tuyến tớnh
+ Giới hạn của phƣơng phỏp
2.5.2 Định lƣợng flavonoid chớnh bằng phƣơng phỏp HPLC
Khảo sỏt lựa chọn chƣơng trỡnh sắc ký thớch hợp để định lƣợng flavonoid chớnh trong nụ và lỏ vối.
Dựa trờn cụng thức phõn tử và cấu trỳc húa học của flavonoid chớnh chiết xuất đƣợc từ dƣợc liệu nụ vối, để tỡm cỏc điều kiện sắc ký phự hợp nhƣ: Bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bƣớc súng phỏt hiện, tốc độ dịng pha động, thể tớch tiờm mẫu, nồng độ dung dịch thử, dung mụi pha mẫu.
Xõy dựng phƣơng phỏp phõn tớch theo cỏc tiờu chỉ tiờu: - Tớnh đặc hiệu.
- Độ tuyến tớnh và khoảng nồng độ tuyến tớnh. - Độ chớnh xỏc.
- Độ đỳng: Độ đỳng đƣợc xỏc định bằng phƣơng phỏp thờm chuẩn và tớnh thơng qua tỷ lệ thu hồi:
Tỷ lệ thu hồi (%) = Hamluongtimthay
Hamluongthucchovao x 100% - Giới hạn của phƣơng phỏp
- Sự phự hợp của hệ thống sắc ký
2.6 Một số đặc trƣng thống kờ để xử lý và đỏnh giỏ kết quả
Cỏc số liệu thực nghiệm đƣợc xử lý bằng phƣơng phỏp thống kờ thụng qua cỏc đặc trƣng sau: - Giỏ trị trung bỡnh: n i i x n x 1 1 - Phƣơng sai: S2 = 2 1 ( ) 1 n i xi x n - Độ lệch chuẩn: SD = 2 1 ( ) 1 n i xi x n - Độ lệch chuẩn tƣơng đối: RSD(%) = SD
2.7 Thiết bị, dụng cụ và húa chất, dung mơi 2.7.1 Thiết bị, dụng cụ 2.7.1 Thiết bị, dụng cụ
- Cõn kỹ thuật Precisa XT 620M - Cõn phõn tớch Precisa XT 220A - Mỏy cất quay Buchi B481 - Tủ sấy Binder – FD 115 - Đốn tử ngoại
- Hệ thống HPLC _ LC10A, hóng Shimadzu (Nhật Bản)
- Mỏy TLC chấm mẫu bỏn tự động CAMAG LINOMAT5, CAMAG REPROSTAR3.
- Mỏy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm, hóng Shimadzu (Nhật Bản)
2.7.2 Húa chất, dung mơi
- Dung mụi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dựng cho sắc ký đạt tiờu chuẩn phõn tớch, dung mơi dựng trong chiết xuất đạt tiờu chuẩn cụng nghiệp đƣợc chƣng cất lại trƣớc khi dựng.
- Bản sắc ký lớp mỏng trỏng sẵn Silica gel GF254 (Merck). - Silica gel sắc ký cột pha thƣờng, cỡ hạt 40-63àm (Merck).
- Húa chất: cỏc húa chất để làm cỏc phản ứng định tớnh bằng phƣơng phỏp húa học, định tớnh phƣơng phỏp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lƣợng bằng phƣơng phỏp đo quang, HPLC.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Chiết xuất và phõn lập một flavonoid chớnh từ nụ vối 3.1.1. Chiết xuất dƣợc liệu và phõn đoạn
Cõn 8 kg dƣợc liệu (nụ vối) làm khụ, chiết bằng ethanol 96% bằng phƣơng phỏp ngõm lạnh, cho ethanol ngập hết dƣợc liệu, thời gian ngõm là 1 tuần/lần rỳt dung dịch chiết, ngõm 3 lần (dịch đó nhạt màu). Dung dịch chiết thu đƣợc, đem cất thu hồi dung mụi ethanol và cụ cỏch thủy, thu đƣợc cao toàn phần (1192 g). Lấy 1000 g cao đem hũa tan một lƣợng vừa đủ 0,5 lớt ethanol 96%, và tiếp tục bổ xung thờm 1,5 lớt nƣớc cất để hịa tan. Sau đú lắc chiết với
n-hexan theo tỉ lệ 1:1 đến nhạt màu (5 lần), thu hồi dung mụi n-hexan đƣợc cao
chiết n-hexan (cao H, 241,5 g). Phần dịch chiết cũn lại tiếp tục đem lắc, chiết
với ethyl acetat theo tỉ lệ 1:1 đến nhạt màu (5 lần), cất thu hồi dung mụi ethyl acetat đƣợc cao chiết ethyl acetat (cao E, 640 g). Dung dịch chiết cũn lại đƣợc lắc chiết với n-butanol (5 lần), cất thu hồi n-butanol, ta thu đƣợc cao chiết n-
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết và phõn đoạn cao nụ vối
3.1.2 Phõn lập flavonoid chớnh trong cao phõn đoạn ethyl acetat
Để định hƣớng cho việc phõn lập, tiến hành thử định tớnh flavonoid trong cỏc cao H, cao E. Lấy 0,02g cao H, cao E hũa tan vào 10ml methanol ta đƣợc cỏc dung dịch H, E tƣơng ứng.
* Phản ứng tạo màu với FeCl3 5%: Lấy riờng 1 ml dung dịch H, E (ở
trờn) cho vào từng ống nghiệm sau đú cho vào mỗi ống nghiệm 1 giọt FeCl3 5% lắc và quan sỏt màu. Kết quả chỉ ra ở bảng 3.1.
Lắc chiết với n-butanol (làm lặp lại 5 lần) Lắc chiết với ethyl acetat (làm lặp lại 5 lần) Lắc chiết với n-hexan (làm lặp lại 5lần)
Dung dịch ethy acetat Dung dịch nƣớc
Dung dịch n-butanol Dung dịch nƣớc Cao n- hexan Cao Ethyl Cao n- butanol Dung dịch nƣớc Cao tổng Dung dịch n-hexan Dung dịch nƣớc
* Phản ứng với NaOH 10%: Lấy riờng 1 ml dung dịch H, E (ở trờn) cho
vào từng ống nghiệm sau đú cho vào mỗi ống nghiệm1 giọt NaOH 10% lắc và quan sỏt màu. Kết quả chỉ ra ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả định tớnh sơ bộ flavonoid ở cao H và cao E
Mẫu Thuốc thử hiện màu
Dung dịch NaOH 10% Dung dịch FeCl3 5%
Cao H Khụng phản ứng Khụng phản ứng
Cao E Xuất hiện tủa màu vàng Dung dịch màu xanh đen
Qua kết quả định tớnh sơ bộ bảng 3.1 cho thấy trong phõn đoạn cao E cú chứa flavonoid, việc phõn lập một flavonoid chớnh đƣợc thực hiện từ cao E.
* Sắc ký cột:
Hịa một ớt cao phõn đoạn EtOAc trong methanol, tiến hành khảo sỏt bằng phƣơng phỏp SKLM để lựa chọn phƣơng phỏp chạy sắc ký cột phự hợp nhất, thử với một số hệ dung mụi Hx : ethyl acetat, Hx : cloroform…, kết quả khảo sỏt cho hệ dung mụi Hx : ethyl acetat là phự hợp nhất. Vỡ vậy tiến hành sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha thuận cỡ hạt 40-63 àm, pha động là Hx : ethyl acetat với tỉ lệ tăng dần độ phõn cực.
* Chuẩn bị silica gel
Cõn khoảng 600g silica gel pha thƣờng cho vào cốc cú mỏ dung tớch 1000 ml, thờm n-hexan cho ngập bề mặt silica gel 4-5 cm, khuấy đều, cho bay hết khớ.
* Chuẩn bị cột sắc ký
Dựng cột thủy tinh trung tớnh cú đƣờng kớnh 10 cm, chiều dài 100 cm đƣợc lắp thẳng đứng trờn giỏ, phớa dƣới cột cú van điều chỉnh tốc độ chảy của
dung mơi. Lút một lớp bơng mỏng ở đỏy cột, ngay trờn van để chất nhồi sau khi đƣợc nhồi vào cột khụng gõy tắc. Đổ từ từ silica gel đó chuẩn bị ở trờn vào cột sao cho cột khụng bị rỗ, bề mặt cột phẳng và để yờn cho cột ổn định. Mở khúa cho dung mụi chảy và thờm n-hexan để ổn định cột.
* Chuẩn bị mẫu và đưa lờn cột
Cõn khoảng 300g cao phõn đoạn EtOAc hịa tan hồn tồn bằng một lƣợng tối thiểu methanol, rồi đem mẫu đú tẩm với khoảng 100 g silica gel pha thƣờng. Sau đú đổ phần silica gel đó tẩm mẫu ra khay để bay hơi hết dung mụi, rồi đem sấy ở 50oC cho đến khơ. Nếu thấy vún cục thỡ cú thể dựng chày và cối sứ nghiền nhỏ để cú đƣợc hạt silica gel đó tẩm chất là mịn nhất. Sau khi chuẩn bị xong mẫu, đƣa mẫu từ từ vào cột sao cho khụng bị xỏo trộn lớp chất nhồi bờn trong cột, dựng pipet trỏng vũng quanh bờn trong cột trƣớc khi thờm dung mụi rửa giải.
* Tiến hành sắc ký cột
Tiến hành chạy cột với hệ dung mụi n-hexan: ethyl acetat với độ phõn
cực tăng dần (tỉ lệ dung mụi từ 49:1 đến 1:1). Dựng bỡnh nún cú thể tớch 250 ml để hứng dung dịch ra khỏi cột, thu đƣợc 32 bỡnh (200 ml). Tất cả cỏc bỡnh hứng đều đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Bằng cỏch này, ta thấy từ bỡnh 04 đến bỡnh 09 cho sắc đồ giống nhau cú 1 vết màu vàng (hỡnh 3.1), gộp cỏc bỡnh này lại, cất thu hồi dung mụi và cụ cỏch thủy đến khụ thu đƣợc chất rắn cú màu da cam, gọi là chất rắn CO-1 (4,329 g). Khi kiểm tra lại bằng phƣơng phỏp SKLM pha thƣờng với 2 hệ dung mụi là : n-hexan:ethyl acetat (2:1), CHCl3:MeOH
(20:1), và SKLM pha đảo với hệ dung mụi MeOH:nƣớc (20:1), chất rắn CO-1
a) Hỡnh ảnh SKLM b) Hỡnh ảnh chất CO-1
Hỡnh 3.1: Hỡnh ảnh SKLM và chất CO-1 phõn lập từ nụ vối
3.1.3. Xỏc định cấu trỳc chất phõn lập
Chất rắn CO-1 là tinh thể cú màu vàng da cam, cú điểm núng chảy 125- 1270C. Kiểm tra độ tinh khiết bằng mỏy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phõn lập đƣợc cú độ tinh khiết 98,21% tớnh theo diện tớch pic,
sắc ký đồ thể hiện ở hỡnh 3.2 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m AU 0 100 200 34016 1457 5242 1199 1875 691 2476 66 6412 2036 1009 2351 1201 15949 4250687 506 116 160 102 142 300 197 358 314 146 113 259 545 258 165 179 252 83 251 206 966 581 381 144 9: 341 nm, 8 nm nuvoistd
nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat
Area
Phổ UV (MeOH) của chất CO-1 cho đỉnh hấp thụ cực đại ở λ= 340nm,
nằm trong vựng hấp thụ mạnh của cỏc chalcon (300-400nm) [4] .
Hỡnh 3.3: Phổ tử ngoại (UV) chất CO-1
Phổ hồng ngoại cho đỉnh hấp thụ ở νmax = 3371 cm-1 đặc trƣng cho dao động húa trị của nhúm OH liờn kết hydro, đỉnh ở νmax =2938 cm-1
đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C-H, đỉnh ở νmax =1626 cm-1
đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C=O, đỉnh ở νmax =1537 cm-1
đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C=C, đỉnh ở νmax =1166 cm-1
đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C-O. Nhƣ vậy, trong cụng thức của hợp chất 1 cú nhúm –OH, nhúm C-O, nhúm C=O và liờn kết đụi C=C. (xem phụ lục)
Phổ 1
H-NMR (CD3OD, 500MHz) : cú độ dịch chuyển δ ppm: Cú 2 pic methyl (CH3, δH =2,076, s, và δH 2,13, s), 1 pic methoxy (OCH3, δH 3,64, s), một nhúm gồm 5 proton thuộc vũng thơm δH 7,405-7,453 và 7,652-7,671. Điều này khẳng định chất CO-1 cú vịng thơm. Hai proton cú độ dịch chuyển δH 8,02
(d) và δH 7,78 (d) cú hằng số tƣơng tỏc lớn (J=15,5 Hz), chứng tỏ chất CO-1 cú cấu hỡnh trans. (xem phụ lục).
Phổ 13
C-NMR (CD3OD, 125MHz) cú tất cả 18 tớn hiệu cho biết chất