Nhƣ vậy flavonoid chớnh tỏch đƣợc trong nụ vối là 2′,4′-dihydroxy- 6′methoxy-3′,5′-dimethylchalcone (ký hiệu ngắn gọn là CO-1). Đƣợc xỏc định thụng qua cảm quan, cỏc phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn (1H và 13C NMR), khối phổ (MS) khi so sỏnh với cỏc tài liệu tham khảo [14, 27]. Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đo nhiệt độ núng chảy của CO-1 nhiều lần
đều cho kết quả ổn định ở 125-127oC. Nhƣ vậy, cú thể sử dụng mẫu chất CO-1
phõn lập đƣợc làm chất đối chiếu trong phộp xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh, định lƣợng flavonoid và chất này trong cỏc mẫu nụ và lỏ vối.
3.2 Xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh flavonoid trong lỏ và nụ vối 3.2.1 Định tớnh bằng phản ứng húa học 3.2.1 Định tớnh bằng phản ứng húa học
Lấy 2 g bột dƣợc liệu (nụ, lỏ vối) cho vào bỡnh nún, chiết siờu õm với 20ml ethanol 900 trong 30 phỳt, lọc lấy dịch lọc. Dựng dịch lọc để làm cỏc phản ứng định tớnh.
Nhỏ vài giọt dung dịch chiết lờn miếng giấy lọc, để khụ rồi hơ lờn miệng lọ amoniac đặc, quan sỏt sự thay đổi màu của vết chất thấy vết chất chuyển từ vàng sang vàng đậm.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng với kiềm loóng.
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch natri hydroxid 10%, lắc, dung dịch trong ống nghiệm chuyển màu vàng, sau xuất hiện tủa vàng.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda).
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thờm ớt bột magie kim loại, rồi nhỏ từ từ vài giọt dung dịch acid hydroclorid đậm đặc. Sau vài phỳt dung dịch xuất hiện màu hồng.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng với dung dịch sắt(III) clorid 5%.
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thờm vài giọt dung dịch sắt(III)clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen.
Kết luận: Cú flavonoid
Dựa trờn cỏc tài liệu tham khảo, cỏc cơng trỡnh nghiờn cứu định tớnh flavonoid của cỏc nhà khoa học ở cỏc Trƣờng đại học, cỏc Viện nghiờn cứu ở trong nƣớc và trờn thế giới. Trong luận văn này khẳng định lại một lần nữa cỏc hợp chất vụ cơ nhƣ NH3, NaOH, FeCl3…luụn là những thuốc thử cho phản ứng rất nhạy, tạo màu đặc trƣng cho việc phỏt hiện flavonoid trong thực vật.
3.2.2 Định tớnh bằng TLC
a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký
Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dƣợc liệu (nụ, lỏ vối) cho vào bỡnh nún,
thờm 50 ml methanol (MeOH) rồi đem siờu õm 30 phỳt, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm cỏc phộp định tớnh.
Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chớnh (tỏch đƣợc ở nụ vối)
trong MeOH (hàm lƣợng khoảng 1 mg/ml).
Đƣa chất phõn tớch lờn bản mỏng: Lƣợng mẫu cần đƣa lờn bản mỏng là khoảng 10 μl dung dịch đó pha ở trờn. Cỏc vết chấm cựng trờn một đƣờng xuất phỏt cỏch mộp dƣới của bản mỏng 1,5 cm, đƣờng kớnh vết chấm 3-5 mm và cỏch nhau 15 mm, hai vết chấm ngoài cựng của bản mỏng cỏch mộp ngoài khoảng 1cm.
b) Hệ dung mụi sắc ký: Tiến hành khảo sỏt triển khai sắc ký cho cỏc hệ
dung mụi sau: Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:2:2:1 (v:v:v )
Hệ 2: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nƣớc =10:1:1:2 (v:v:v:v ) Hệ 3: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v )
Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nƣớc = 7:3:1,5:1 (v:v:v) Tiến hành triển khai sắc ký lỏ, nụ vối và chất rắn CO-1. Qua khảo sỏt cỏc hệ dung mụi ở trờn, chỳng tụi thấy với hệ 3 cho kết quả sắc ký đồ tỏch tốt nhất (hỡnh 3.5A) nờn dựng hệ 3 làm hệ dung mụi khai triển.
Tiến hành triển khai chạy sắc ký dịch chiết của nụ, lỏ và chất đối chiếu
CO-1 trờn cựng bản mỏng. Sau đú chỳng tơi tiến hành soi ở cỏc bƣớc súng UV-