CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2 Xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh flavonoid trong lỏ và nụ vối
3.2.2 Định tớnh bằng TLC
a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký
Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dƣợc liệu (nụ, lỏ vối) cho vào bỡnh nún,
thờm 50 ml methanol (MeOH) rồi đem siờu õm 30 phỳt, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm cỏc phộp định tớnh.
Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chớnh (tỏch đƣợc ở nụ vối)
trong MeOH (hàm lƣợng khoảng 1 mg/ml).
Đƣa chất phõn tớch lờn bản mỏng: Lƣợng mẫu cần đƣa lờn bản mỏng là khoảng 10 μl dung dịch đó pha ở trờn. Cỏc vết chấm cựng trờn một đƣờng xuất phỏt cỏch mộp dƣới của bản mỏng 1,5 cm, đƣờng kớnh vết chấm 3-5 mm và cỏch nhau 15 mm, hai vết chấm ngoài cựng của bản mỏng cỏch mộp ngoài khoảng 1cm.
b) Hệ dung mụi sắc ký: Tiến hành khảo sỏt triển khai sắc ký cho cỏc hệ
dung mụi sau: Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:2:2:1 (v:v:v )
Hệ 2: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nƣớc =10:1:1:2 (v:v:v:v ) Hệ 3: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v )
Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nƣớc = 7:3:1,5:1 (v:v:v) Tiến hành triển khai sắc ký lỏ, nụ vối và chất rắn CO-1. Qua khảo sỏt cỏc hệ dung mụi ở trờn, chỳng tụi thấy với hệ 3 cho kết quả sắc ký đồ tỏch tốt nhất (hỡnh 3.5A) nờn dựng hệ 3 làm hệ dung mụi khai triển.
Tiến hành triển khai chạy sắc ký dịch chiết của nụ, lỏ và chất đối chiếu
CO-1 trờn cựng bản mỏng. Sau đú chỳng tơi tiến hành soi ở cỏc bƣớc súng UV-
Hỡnh 3.5A: Sắc ký đồ định tớnh flavonoid trong nụ và lỏ vối
C: Chất chuẩn CO-1 N: Nụ vối L: Lỏ vối A: UV-254nm
B: Ánh sỏng trắng (trƣớc khi phun thuốc thử) C: UV- 366nm
D: Ánh sỏng trắng (sau khi phun thuốc thử) E: UV-366 sau khi phun thuốc thử
Cỏc sắc ký đồ hỡnh (A,B,C) cho thấy flavonoid trong nụ, lỏ vối cho cỏc vết màu đen xỏm khi soi dƣới UV-254 nm và UV-366 nm. Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% /ethanol và sấy ở 1050C, ở miền ỏnh sỏng trắng cho cỏc vết cú màu vàng (Rf =0,47) đặc trƣng của flavonoid.
Với thuốc thử acid boric/acid oxalix với tỷ lệ 2:1 cho ta kết quả sắc ký đồ ở hỡnh D, E nhƣ sau: Cũng cho một vệt xỏm đen khi soi ở bƣớc súng UV-366 nm, Sau khi sấy ở 1050C cho ta một vết màu vàng (Rf = 0,47) đặc trƣng của flavonoid.
Nhƣ vậy cú thể sử dụng hệ 3 làm hệ dung mụi cho việc triển khai sắc ký để định tớnh flavonoid trong việc xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở cho dƣợc liệu nụ, lỏ vối.
a) Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: hịa tan một ớt cao đặc nụ vối và cao phõn
đoạn EtOAc trong MeOH.
Dựng bản mỏng silica gel 60F254 đó trỏng sẵn và hoạt húa ở 110o
C/ 60 phỳt. b) Hệ dung mụi khai triển:
Hệ 1: Toluen : EtOAc : Aceton : Acid formic = 5:2:2:1 (v:v:v ) Hệ 2: EtOAc : Acid acetic : Acid formic : Nƣớc = 10:1:1:2 (v:v:v ) Hệ 3: Toluen : EtOAc : Acid formic = 6:4:1 (v:v:v )
Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nƣớc = 7:3:1,5:1 (v:v:v ) Qua khảo sỏt cỏc hệ dung mụi khỏc nhau, hệ dung mụi 3 cho kết quả tỏch cỏc chất cú trong cao EtOAC của nụ vối là tốt nhất. Cho nờn dựng hệ 3 làm hệ dung mụi khai triển và kết quả đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.5B và bảng 3.3.
A B C D
Hỡnh 3.5B: Sắc ký đồ định tớnh flavonoid trong cao ETOAC
1: Cao tổng nụ vối. 2: Cao phõn đoạn EtOAc nụ vối (A). Quan sỏt ở UV 254nm (B).Quan sỏt ở UV 365nm
Bảng 3.3. Kết quả SKLM cao phõn đoạn EtOAc TT Rf x 100 Màu sắc UV 254 nm UV 365 nm AS thƣờng (Hơ amoniac) AS thƣờng H2SO4/cồn
1 89,7 Nõu đậm Lam đậm Cam nhạt Nõu nhạt
2 76,9 Nõu nhạt Xanh nhạt Tớm đậm
3 69,2 Nõu nhạt Xanh nhạt Tớm nhạt
4 64,1 Nõu đậm Xanh sỏng Tớm nhạt
5 53,8 Nõu đậm Xanh sỏng Tớm nhạt
6 46,1 Nõu nhạt Lam nhạt Tớm nhạt
7 39,2 Nõu nhạt Nõu nhạt Nõu nhạt
8 37,2 Nõu nhạt
9 24,4 Nõu nhạt Lam nhạt Nõu nhạt
10 19,2 Nõu nhạt Xanh sỏng Tớm nhạt Tớm nhạt
Trờn sắc ký đồ cho thấy ở UV-254 nm, UV-365 nm và sau khi nhỳng H2SO4 10%/ cồn, cao phõn đoạn EtOAc cú 10 vết cú Rf và màu sắc tƣơng đƣơng với cao đặc nụ vối. Khi hơ amoniac thỡ cao đặc nụ vối và cao phõn đoạn EtOAc đều cú 4 vết cú Rf và màu sắc tƣơng đƣơng.
Nhƣ vậy dựa vào cấu trỳc, độ phõn cực của flavonoid và khả năng tỏch trờn bản mỏng, chỳng tụi đó đƣa ra đƣợc 2 hệ dung mụi là: n-Hexan : EtOAc :
Acid formic (6:3:0,1) và Toluen : EtOAc : Acid formic (6:4:1) phự hợp để định tớnh sự cú mặt của flavonoid trong dƣợc liệu vối bằng phƣơng phỏp TLC.