Nồng Độ (mg/ml) 0,11 0,1375 0,22 0,275 0,367 0,55 Diện tớch Pớc 4575033 7119423 12105281 14809513 16490167 20791750 Giới hạn LOL 0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nồng độ CO-1 (mg/ml) D iệ n tớ ch p ic Hỡnh 3.13: Đồ thị xỏc định nồng độ giới hạn LOL
Từ kết quả (Bảng 3.21 và Hỡnh 3.13) cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 0,275 mg/ml, tại nồng độ này trở đi trờn đồ thị cho thấy diện tớch pớc và nồng độ khơng cịn tuyến tớnh. Nhƣ vậy, khoảng nồng độ tuyến tớnh CO-1 để định
lƣợng cho kết quả tốt nhất đƣợc xỏc định nằm trong khoảng 0,1-275 μg/ml.
3.3.2.6 Đỏnh giỏ sai số và độ lặp của phƣơng phỏp
Để đỏnh giỏ sai số và độ lặp lại của phƣơng phỏp ta dựng đƣờng chuẩn, pha 3 mẫu cú nồng độ ở điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tớnh. Thực hiện đo mỗi mẫu 6 lần trong cỏc điều kiện nhƣ nhau và đó đƣợc chọn ở trờn.
Sai số tớnh theo cụng thức: %X = ( i t) t S S S .100 Trong đú: %X: Sai số phần trăm tƣơng đối Si: Diện tớch pic thu đƣợc
St: Diện tớch thu đƣợc theo đƣờng chuẩn
Độ lặp lại của phƣơng phỏp đƣợc xỏc định theo cỏc đại lƣợng S2 và %RSD. Cỏc đại lƣợng này đƣợc tớnh theo cơng thức nhƣ mục 2.6.
Bảng 3.22: Bảng kết quả đỏnh giỏ sai số của phương phỏp
Mẫu 1 2 3 CC.01(mg/ml) 0,0055 0,0275 0,11 Spic 274600 1154600 4454600 Lần đo Si %X Si %X Si %X 1 269653 1,80 1138335 1,41 4475033 0,46 2 269534 1,84 1136425 1,57 4475642 0,47 3 269763 1,76 1137653 1,47 4474832 0,45 4 269742 1,77 1136872 1,54 4476321 0,49 5 269364 1,91 1138356 1,41 4475086 0,46 6 269583 1,83 1137672 1,47 4473762 0,43 Stb 269607 1,82 1137552 1,48 4475113 0,46 SD 5,5.10-2 6,6.10-2 2.10-2 RSD (%) 3,02 4,46 4,35
Kết quả khảo sỏt cho thấy độ lệch chuẩn và sai số tƣơng đối của phƣơng phỏp đều nhỏ và nằm trong giới hạn cho phộp (10%). Qua đú cho thấy phƣơng phỏp phõn tớch ổn định, cú độ lặp lại tốt, đồng thời cú độ chớnh xỏc cao, phự hợp cho việc xỏc định hàm lƣợng CO-1 trong nụ và lỏ vối.
3.3.2.7 Kết quả định lƣợng flavonoid chớnh (CO-1) trờn mẫu thực
Áp dụng quy trỡnh đó xõy dựng đƣợc để định lƣợng một số mẫu nụ và lỏ vối thu hỏi tại miền bắc Việt Nam.
Cỏc dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử đƣợc chuẩn bị nhƣ phần mục 3.3.3
Bảng 3. 23: Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu nụ và lỏ vối
STT Tờn mẫu
(nơi thu hỏi) lƣợng Khối cõn (g) Độ ẩm (%) Pic S (A U.s) Hàm lƣợng chất CO-1 (mg/g) (% kl/kl) Cỏc mẫu nụ vối 1 Chợ Đồng Xuõn (HN) 1,0709 12,62 1324731 16,81 ± 0,058 1,68 2 Hƣng Yờn 1,0007 11,18 1377958 18,61 ± 0,184 1,86 3 Nam Định 1,0113 11,14 1022567 13,45 ± 0,160 1,35 4 Hải Dƣơng 1,0032 7,65 1143549 14,69 ± 0,093 1,47 5 Hà Đụng (HN) 1,0057 6,77 1048407 13,24 ± 0,030 1,32 6 Hà Nam 1,0266 8,00 1066353 13,36 ± 0,125 1,34 7 Thỏi Nguyờn 1,0003 7,85 1067456 13,74 ± 0,173 1,37 Cỏc mẫu lỏ vối 8 Bắc Giang 1,0020 9,30 3447931 4,661 ± 0,058 0,47 9 Bắc Ninh 1,0017 11,50 3158279 4,376 ± 0,053 0,44 10 Hà Đụng (HN) 1,0028 11,10 3178280 4,377 ± 0,029 0,44 11 Hịa Bỡnh 1,0180 15,10 3379762 4,792 ± 0,030 0,48 12 Phỳ Thọ 1,0066 8,70 3449983 4,625 ± 0,045 0,46 13 Quảng Ninh 1,0221 11,50 3312138 4,493 ± 0,023 0,49 14 Thỏi Bỡnh 1,0380 10,90 3258986 4.327 ± 0,029 0,43
Kết quả định lƣợng cỏc mẫu thu hỏi tại một số địa phƣơng ở miền bắc Việt Nam cho biết hàm lƣợng CO-1 trong lỏ vối nằm trong khoảng 0,43 -
0,49%, thấp hơn nhiều so với hàm lƣợng trong nụ vối trong khoảng 1,32 – 1,86%. Kết quả nghiờn cứu này gợi ý cho việc xõy dựng tiờu chuẩn cho dƣợc liệu nụ và lỏ vối để kiểm nghiệm chất lƣợng dƣợc liệu vối sử dụng cho y học cổ truyền.
KẾT LUẬN
1. Đó phõn lập đƣợc một flavonoid chớnh (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'- dimethylchalcone) trong nụ vối làm chất đối chiếu trong xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh, định lƣợng flavonoid.
Xỏc định đƣợc độ tinh khiết của flavonoid chớnh bằng HPLC (98,21%). 2. Đó xõy dựng đƣợc phƣơng phỏp định tớnh flavonoid trong nụ và lỏ vối bằng cỏc phản ứng húa học, sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Đó đƣa ra cỏc phản ứng định tớnh flavonoid trong nụ và lỏ vối gồm: phản ứng với cỏc thuốc thử NH3, NaOH, (Mg + HCl), và FeCl3.
Tỡm ra đƣợc hệ dung mụi định tớnh flavonoid trong sắc ký bản mỏng (TLC) gồm: Hệ 1: n-Hexan : EtOAc : Acid formic = 6:3:0,1 (v:v:v ) và hệ 2: Toluen : EtOAc : Acid formic = 6:4:1 (v:v:v).
Định tớnh đƣợc flavonoid chớnh bằng HPLC thơng qua thời gian lƣu (tR = 9,3 phỳt) và so sỏnh với chất đối chiếu CO-1 đƣợc tỏch từ nụ vối.
3. Xõy dựng đƣợc phƣơng phỏp định lƣợng flavonoid: a) Bằng phƣơng phỏp trắc quang
Xõy dựng đƣợc phƣơng phỏp định lƣợng flavonoid toàn phần theo chất đối chiếu CO-1 (đƣợc tỏch từ nụ vối) và theo catechin.
Xỏc định đƣợc khoảng tuyến tớnh và đƣờng chuẩn xỏc định lƣợng flavonoid là ; Giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lƣợng của phộp đo nằm trong khoảng LOD = 0,77 mg/l, LOQ = 2,55 mg/l (theo chất đối chiếu CO-1) và
LOD = 1,05 mg/l, LOQ = 3,51 mg/l (theo chất chuẩn catechin) ; Độ đỳng, độ ổn định của phƣơng phỏp phự hợp.
Đó xỏc định đƣợc hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong 14 mẫu nụ và lỏ vối thu hỏi ở cỏc tỉnh miền bắc Việt Nam. Kết quả cho biết hàm lƣợng trong cỏc mẫu nụ là 25,791 – 30,995 mg/g, mẫu lỏ 15,443 – 22,418 mg/g (tớnh theo chất đối chiếu CO-1). Tớnh theo chất chuẩn catechin : mẫu nụ là 34,978 – 42,114
mg/g, mẫu lỏ 20,728 – 30,331 mg/g. Kết quả đó đỏnh giỏ đƣợc hàm lƣợng flavonoid trong nụ vối cao hơn trong lỏ vối cú ý nghĩa thống kờ.
b) Bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Đƣa ra đƣợc điều kiện, dung mụi phự hợp chạy sắc ký trong việc định lƣợng flavonoid chớnh trong nụ và lỏ vối
Xỏc định đƣợc khoảng tuyến tớnh (0,1 – 275 μg/ml) và lập đƣờng chuẩn của flavonoid.
Xỏc định đƣợc giới hạn phỏt hiện (LOD = 0,031 μg/ml) và giới hạn định lƣợng của phộp đo (LOQ = 0,1023 μg/ml) .
Đỏnh giỏ đƣợc sai số và độ lặp lại của phộp đo.
Đó xỏc định đƣợc hàm lƣợng của 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'- dimethylchalcone trong một số mẫu lỏ (4,3272 – 4,7924 mg/g) và nụ vối (13,2437 – 18,6095 mg/g) thu hỏi ở cỏc tỉnh phớa Bắc.
Tài liệu tham khảo I. Tiếng việt
1. Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nội. tr. 72-79. 2. Bộ Y tế (2007), Húa phõn tớch II, NXB Y học, Hà Nội. tr.13-20.
3. Đỗ Huy Bớch, Đặng Quang Chung, Bựi Xuõn Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Món, Đồn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn – Viện Dƣợc liệu (2004),
Cõy thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II NXB Y học, tr. 1065-1066.
4. Vừ Văn Chi (1997), Từ điển cõy thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 1330. 5. Dược điển Việt Nam 3, NXB Y học 2004.
6. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương phỏp nghiờn cứu húa học cõy thuốc, NXB Y Học.
7. Đào Thị Thanh Hiền (2000), “Gúp phần nghiờn cứu cõy vối (Cleistocalyx
operculatus (Roxb.) Merr. et Perry Myrtaceae)”, Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ
Dƣợc học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
8. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuõn Trung, Nguyễn Văn Ri (2003),
Cỏc phương phỏp phõn tớch cơng cụ, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
9. Trần Hựng (2007), Giỏo trỡnh, Phương phỏp nghiờn cứu dược liệu, Đại học Y Dƣợc Tp HCM.
10. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cõy thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội, tr. 423.
11. Phạm Luận (2000), Giỏo trỡnh, Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao,
Đại Học Khoa Học Tự Nhiờn-ĐHQGHN
12. Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết của phương phỏp phõn tớch phổ hấp thụ
13. Hoàng Thị Lý (2011), Xõy dựng tiờu chuẩn dược liệu nụ vối, khúa luận tốt
nghiệp dƣợc sĩ, Trƣờng đại học Dƣợc Hà nội.
14. Trƣơng Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Lõm, Nguyễn Cụng Khẩn, Nguyễn Văn Chuyển, Nagashima Fumie “Tỏc dụng chống oxy húa của nụ vối trờn ống nghiệm và trờn chuột tiểu đường” Tạp chớ Y học dự phịng, 2009, số 5 (104).
15. Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012), Nghiờn cứu chiết xuất và tinh chế Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc, Luận ỏn Tiến sỹ - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
16. Nguyễn Văn Ri, giỏo trỡnh mơn học, Cỏc phương phỏp tỏch, Đại học Khoa học Tự Nhiờn - ĐHQGHN
17. Ngụ Văn Thu, Bài giảng dược liệu, tập 1, Bộ y tế và Bộ giỏo dục Hà Nội. 18. Nguyễn Thị Kim Tuyến, Nguyễn Văn Thanh, Hồng Văn Lựu, Chu Đỡnh Kớnh (2010). “Tỏch và xỏc định cấu trỳc một số hợp chất từ nụ và hoa cõy vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr. et Perry) ở Nghệ An”. Tạp chớ Dược học 405, tr. 44-46.
19. Tạ Thị Thảo, giỏo trỡnh mơn học, Thống kờ trong húa phõn tớch, Đại học
Khoa học Tự Nhiờn-ĐHQGHN.
20. Trần Quang Vinh (2009), Sự thay đổi hàm lượng flavonoid trong lỏ của cõy
chựm ngõy (Moringa oleifera Lam.) theo cỏc giai đoạn phỏt triển, Luận văn
thạc sĩ Trƣờng Đại học hoa Khọc Tự Nhiờn - ĐHQG HCM
21. Viện Dƣợc liệu (2008), Chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học và Kỹ thuật,
Hà Nội. tr. 11-29, 39-49, 66-76.
22. Viện Dƣợc liệu – Sở Y tế tỉnh Nghệ an (2009), Cõy thuốc Nghệ an, tr. 606- 608.
23. Viện Dƣợc liệu (2006), Nghiờn cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và
Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 494.
24. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương
phỏp trong phõn tớch húa học và vi sinh vật, NXB khoa học và kỹ thuật Hà nội.
II. Tiếng anh
25. Arvouet A., B. Vennat, A. Pourrat and Legret (1994), “Sandardisation of an extract of Propolis and identification of the major compounds”, J. Pharm. Belgg., Vol. 49 pp. 462-468.
26. Brỏs H. de Oliveira , Tomoe Nakashima ,Josộ D. de Souza Filho and Fabiano L. Frehse (2001), “HPLC Analysis of Flavonoids in Eupatorium littorale” J. Braz. Chem. Soc., Vol. 12, No. 2, pp. 243-246.
27. Byung-Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Beom-Soo Shin, Mi Hee Woo, Tran Manh Hung (2010), “Cholinesterase Inhibitors from Cleistocalyx operculatus Buds”, Archives of Pharmacal Research 33(10), pp. 1665-1670.
28. Byung Sun Min, To Dao Cuong, Joo-Sang Lee, Mi Hee Woo, and Tran Manh Hung (2010), “Flavonoids from Cleistocalyx operculatus Buds and their
Cytotoxic Activity” Bull. Korean Chem. Soc., Vol.31, No.8. pp. 2392-2394 29. Chun-Lin Ye ,Jian-Wen Liu , Dong-Zhi Wei Yan-Hua Lu , Feng Qian (2005), “In vivo antitumor activity by 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'- dimethylchalcone in a solid human carcinoma xenograft model”, Cancer Chemotherapy and Pharmacology 56(1), pp. 70-74.
30. Chun-Lin Ye, Jian-Wen Liu, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Feng Qian (2004), “In vitro anti-tumor activity of 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'- dimethylchalcone against six established human cancer cell lines”,
31. Chun-Lin Ye, Yan-Hua Lu, Dong-Zhi Wei (2004), “Flavonoids from
Cleistocalyx operculatus”, Phytochemistry 65(4), pp. 445–447
32. C-L Ye, Y-H Lu, X-D Li, D-Z Wei (2005), “HPLC analysis of a bioactive Chalcone and tritecpence in the buds of Cleistocalys operculatus” South African Journal of Botany, 71 (3&4) pp. 312-315.
33. Dao Trong Tuan et al. (2010), “C-Methylated flavonoids from Cleistocalyx operculatus and their inhibitory effects on novel influenza A (H1N1)
neuraminidase”. Journal of Natural Products 73, pp. 1636-1642.
34. Elisabetta Campeol, Serena Catalano, Roberto Cremon Ini and Ivano Morell (2000), “Flavonoids analysis of Vicia species of Narbonensis complex: V. kalakhensis Khatt. Maxt & Bisby and V.eristalioides Maxt” Caryologia Vol. 53, No.1, pp. 63-68.
35. Feng Quian, Chun-Lin Ye, Dong-Zhi Wei, Yan-Hua Lu, Song-Lin Yang (2005), “In vitro and in vivo reversal of cancer cell multidrug resistance by 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone”, Journal of Chemotherapy
17(3), pp. 309-314.
36. Han-Yao Huang, Jian-Lei Niu, Yan-Hua Lu (2012), “Multidrug resistance reversal effect of DMC derived from buds of Cleistocalyx operculatus in human hepatocellular tumor xenograft model”, Journal of the science of food and agriculture 92(1), pp. 135-140.
37. James M. Harnly, Robert F. Doherty, Gary R. Beecher, Oanne M.Holden, David B. Haytowitz, Seema Bhagwat, and Susan Gebhardt,(2006), “Flavonoid Content of U.S. Fruits, Vegetables, and Nuts” J. Agric. Food Chem. 54, pp.
38. Lui Alberto Lira Soares, Valquớria Link Bassani, George Gonzỏlez Ortega & Pedro Ros Petrovick (2003), “Total Flavonoid Determination for the Quality Control of Aqueous Extractives from Phyllanthus niruri L.” Lat. Am. J. Pharm. 22 (3), pp. 203-207.
39. L.-Tao, Z-T.Wang, E.-Y.Zhu, Y.-H.Lu, D.-Z.Wei (2006), “HPLC analysis of bioactive flavonoids from the rhizome of Alipinia officinarum” South African
Journal of Botany 72 (2006), pp. 163-166.
40. Marica Medić-Šarić, Ivona Jasprica, Asja Smolčić-Bubalo and Ana Mornar (2004), “Optimization of chromatographic conditions in thin layer chromatography of flavonoids and phenolic acids” Croat. Chem. Acta 77(1-2), pp. 361-366.
41. Mudasir Sultana, Pawan Kumar Verma, Rajinder Raina, Shahid Prawez & M A Dar “Quantitative Analysis of Total Phenolic, flavonoids and Tannin Contents in Acetone and n-hexane Extracts of Ageratum conyzoides” International Journal of ChemTech Research CODEN( USA): IJCRGG ISSN : 0974-4290 Vol. 4, No.3, pp. 996-999
42. Nguyen Thi Dung , Jung Min Kim, Sun Chul Kang (2008), “Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and the ethanol extract of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry buds”, Food
and Chemical Toxicology 46, pp. 3632–3639.
43. Tevini, M., Iwanzik, W., Teramura, A.H. (1983), “Effects of UV-B radiation on plants during mild water stress-II. Effects on growth, protein and flavonoid contcent”, Z. Pflanzenphysiol. 110, pp. 459-467.
44. T. Sathishkumar, Baskar.R, Shanmugam.S, Rajasekaran.P, Sadasivam.S and Manikandan.V “Optimization of flavonoids extraction from the leaves of Tabernaemontana heyneana Wall. using L16 Orthogonal design” Nature and Science, 6(3), 2008, ISSN: 1545-0740
45. Truong Tuyet Mai, Nguyen Van Chuyen (2007), “Anti-hyperglycemic activity of an aqueous extract from flower buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 71(1),
pp. 69-76.
46. Truong Tuyet Mai, Nghiem Nguyet Thu, Pham Gia Tien, Nguyen Van Chuyen (2007), “Alpha-Glucosidase inhibitory and antioxidant activities of Vietnamese edible plants and their relationship with polyphenol contents”,
Journal of Nutritional Science and Vitaminology 53(3), pp. 267-276.
47. Waksmundzka H. M., Sherma J., Kowalska T. (2008), “Thin layer Chromatography in Phytochemistry”, CRC Press, Florida. pp. 3-15.