3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện tách 3TC,NVP và AZT
3.1.9. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ đệm
Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện giải (chất điện ly) trong pha động cũng có vai trị quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế, ngƣời ta cố gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính là chất điện giải của điện di. Nhƣ vậy, pha động sẽ không phức tạp, khơng gây khó khăn ảnh hƣởng đến hiệu quả tách. Ở đây tôi chọn Natri tetraborat vừa là chất đệm pH vừa là chất điện giải
Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền Na2B4O7 tại bốn gía trị là 5 mM; 10 mM; 20 mM; 30 mM với điều kiện khảo sát nhƣ sau:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên dung dịch điện li nền là dung dịch Na2B4O7 + SDS 50mM, pH = 9,30.
- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C Hình 3.5. Sắc đồ điện di tại nồng độ đệm 5 mM, 10 mM, 20 mM 5mM 10mM 20mM
Khảo sát nồng độ đệm tại bốn giá trị, càng tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của các hoạt chất càng tăng, thời gian lƣu của chất tan tăng.
Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ các ion tăng, thƣờng làm thay đổi, giảm độ lớn của lớp điện kép, ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác tĩnh điện Culông của chất tan với thành mao quản. Lớp điện kép là một hiện tƣợng sinh ra rất tự nhiện trong mao quản. Lớp điện kép này thƣờng làm cho vùng mẫu di chuyển khơng phẳng qua đó tạo ra sự dỗng chân pic và cuối cùng làm giảm hiệu quả tách, cụ thể nhất ở nồng độ 30 mM.
Lực ion của dung dịch cũng là yếu tố ảnh hƣởng đến dịng EOF và q trình điện di các chất. Nồng độ đệm tăng, lực ion cũng tăng theo, lớp điện kép bị thu hẹp lại kết quả làm giảm thế Zeta và giảm ln tốc độ của dịng EOF. Lực ion lớn, taọ ra dòng điện cao và có hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm mao quản nóng lên, độ nét của pic cũng bị ảnh hƣởng, làm giảm hiệu quả tách. Tại nồng độ dung dịch điện li nền 30 mM nồng độ đệm cao nên cƣờng độ dịng khơng ổn định và sụt tín hiệu.
Nồng độ đệm 5 mM, lực ion thấp hơn, giảm đƣợc cƣờng độ dòng điện I, tăng sự hấp phụ của mẫu lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các chất tan nhanh hơn nhƣng chiều cao, diện tích pic giảm hơn. Còn nồng độ đệm là 20mM thì độ phân giải cũng tăng nhƣng thời gian phân tích dài hơn. Do đó chúng tơi chọn nồng độ 10 mM đệm Borat là điều kiện tối ƣu.