3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện tách 3TC,NVP và AZT
3.1.11. Khảo sát ảnh hƣởng thế điện di
Khảo sát thế điện di tại ba gía trị 15 kV, 20 kV và 22 kV với điều kiện khảo sát nhƣ sau:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên dung dịch điện li nền là dung dịch Na2B4O7 10mM + SDS 50mM, pH = 9,30.
- Bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C
15kV V
Hình 3.7. Điện di đồ ở thế điện di 15kV, 20kV và 22kV
Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế V một chiều nhất định đặt vào hai đầu của mao quản. Thế V này tạo ra lực điện trƣờng E và dịng điện I trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Thế V đƣợc dùng sao cho khơng cho dịng điện I q lớn trong mao quản, dòng này chỉ nên nằm trong khoảng vùng từ 10-75 μA.
Khi tăng thế điện từ 15kV đến 22kV, thời gian di chuyển của các chất càng giảm. Tại thế 15kV và 20kV đạt hiệu quả tách tốt, nhƣng thời gian di chuyển của cấc chất ở 15kV khá lớn gần 14 phút mới xuất hiện pic của chất thứ 3.
Với thế 22kV, thời gian di chuyển ngắn hơn, độ điện di hiệu dụng lớn hơn so với 15kV, 20kV nhƣng kết quả tách kém, độ phân giải giữa pic thứ 1 và pic thứ 2 không cao và chiều cao pic thứ nhất giảm. Vì khi tăng thế V, dịng điện I lớn sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Jun lớn, làm nóng mao quản gây ra sự dỗng pic. Tức là làm giảm hiệu quả tách. Vì vậy chúng tơi chọn thế tại 20kV là phù hợp.
3.1.12. Ảnh hƣởng nhiệt độ của mao quản
Theo [15] lnKi = (H0/R.T) + ( S0
/R )
Trong đó: H0, S0 là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan. R là hằng số khí, và T là nhiệt độ (oK) của cột mao quản
Biểu thức này cho ta thấy hằng số phân bố Ki luôn phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bố Ki đều giảm dần, tùy thuộc vào từng chất mà hệ số này thay đổi khác nhau.
Cũng giống nhƣ khi tăng điện thế V làm ảnh hƣởng tới hiệu ứng nhiệt Jun làm nóng thành mao quản. Nhiệt độ là yếu tố quan trọng. Sự tăng nhiệt độ ít ảnh
hƣởng đến số đĩa hiệu dụng Nef, song có trƣờng hợp khi tăng nhiệt độ lại làm hỏng chất mẫu hay chất đệm nhất là làm thay đổi độ nhớt dung dịch , tạo ra gradient nhiệt độ và nồng độ chất, qua đó làm ảnh hƣởng đến sự điện di.
Song trong CE, sự gradient nhiệt độ ln xảy ra nó chỉ khác nhau ở mức độ. Sự tiêu hao công suất điện từ trƣờng sinh ra nhiệt càng nhiều, thì càng khơng có lợi. Đồng thời sự phân tán nhiệt độ qua thành mao quản ra ngoài, lại làm cho vùng tâm của cột mao quản có nhiệt độ cao hơn vùng sát thành. Sự khác nhau về nhiệt độ sẽ tạo ra sự khác nhau về độ nhớt dung dịch, chỗ nào có nhiệt độ cao hơn thì sẽ có độ nhớt thấp hơn và nhƣ thế cũng dẫn đến làm tăng tính khơng đồng nhất của dung dịch trong các vùng của cột mao quản.
Khi nhiệt độ thay đổi 1 độ, thì dẫn đến sự thay đổi độ nhớt từ 2-3% và qua đó ảnh hƣởng đến giá trị độ điện di μef của chất tan ( chất phân tích), chúng sẽ gây ra sự mở rộng pic. Tức là giảm hiệu quả tách, vì khi độ nhớt giảm sẽ làm giảm số đĩa hiệu dụng Nef của cột tách giảm theo. Tuy nhiên sự khác nhau về nhiệt độ ảnh hƣởng không lớn tới hiệu quả tách nên để bảo vệ cột và hệ thống CE, chúng tôi sẽ làm mát Cột và để Cột trong hệ thống điều nhiệt Cột. Cột đƣợc giữ ổn định ở nhiệt độ phòng 250C.
3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ƣu
Bảng 3.1. Tổng kết các điều kiện tối ưu
Các yếu tố Điều kiện
Detector DAD
Số đo bƣớc sóng chung Lamivudin 270nm, Zidovudine 264,5 nm và Nevirapin 268,5nm
Kích thƣớc mao quản Mao quản silica trần, tổng chiều dài 64.5cm, chiều dài hiệu dụng 60 cm, đƣờng kính trong 75µm, loại bubble cell.
Chất tạo mixen SDS
Phƣơng pháp bơm mẫu Thủy động hoc : 5s; 50 mbar
Dung dịch điện ly Na2B4O7 10mM + SDS 50mM, pH = 9,30.
Nhiệt độ 250C
Hình 3.8. Điện di đồ của 3TC, AZT, NVP tại điều kiện tối ưu.
3.1.14. Định tính Lamivudin, Nevirapin và Zidovudin trong điều kiện điện di đã thiết lập
Chúng tơi định tính 3TC, NVP và AZT theo phƣơng pháp thêm chuẩn.
Tiến hành chạy điện di lần lƣợt các mẫu: chuẩn hỗn hợp 3TC, NVP và AZT;chuẩn hỗn hợp sau khi thêm chuẩn 3TC; chuẩn hỗn hợp sau khi thêm chuẩn NVP; chuẩn hỗn hợp sau khi thêm AZT, thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Hình 3.9. Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, NVP, AZT.
Hình 3.10. Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, NVP, AZT sau khi thêm chuẩn 3TC
Hình 3.11. Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, NVP, AZT sau khi thêm chuẩn NVP
Hình 3.12 . Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, NVP, AZT sau khi thêm chuẩn AZT Nhận xét: Để khẳng định chắc chắn về thứ tự các chất tới detector trong phƣơng pháp MEKC mà chúng tôi đã xây dựng, chúng tôi tiến hành thêm từng chất chuẩn vào chuẩn hỗn hợp Lamivudin, Nevirapin & Zidovudin và xem xét sự thay đổi đáp ứng của từng chuẩn. Kết quả trên điện di đồ hình cho thấy pic di chuyển tới detector thứ nhất có đáp ứng (diện tích pic) tăng vọt lên (từ 47,42 lên 83,28) khi thêm 3TC chuẩn nên chất di chuyển đến Detector sớm nhất là Lamivudin .Tƣơng tự
chất di chuyển đến Detector thứ hai là Zidovudin và chất di chuyển đến Detector cuối cùng là Nevirapin.
3.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích 3.2.1. Khảo sát tính tƣơng thích hệ thống 3.2.1. Khảo sát tính tƣơng thích hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần cùng một mẫu chuẩn trên. Kết quả phân tích đƣợc trình bày ở bảng sau: Bảng 3.2. Bảng khảo sát tính tương thích hệ thống STT TM 3TC Spic 3TC TM AZT Spic AZT TM NVP Spic NVP Rs (3TC &AZT) Rs (AZT &NVP) 1 5,154 66,3 5,567 126,2 9,745 125,3 8,69 90,24 2 5,172 66,7 5,586 125,9 9,829 124,7 9,52 91,84 3 5,161 66,4 5,596 126,1 9,766 125,1 9,28 93,51 4 5,202 67,2 5,632 126,6 9,975 126,2 9,01 82,72 5 5,195 66,3 5,651 125,4 9,755 127,0 9,13 80,87 6 5,382 66,0 5,850 126,6 9,613 125,9 9,67 74,07 X 5,211 66,65 5,647 126,13 9,78 125,7 SD 0,086 0,054 0,104 0,455 0,118 0,837 RSD% 1,65 0,83 1,8 0,36 1,21 0,67
Nhận xét: kết quả thống kê cho thấy sau 6 lần điện di thơng số thời gian di chuyển và diện tích pic có RSD < 2%, giá trị độ phân giải lớn hơn 1,5. Vậy phƣơng pháp đạt tính tƣơng thích hệ thống ( Thẩm định phƣơng pháp theo ICH)
3.2.2. Tính đặc hiệu
Chúng tơi đã tiến hành điện di mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử theo điều kiện điện di tối ƣu( theo ICH). Kết quả thu đƣợc nhƣ hình bên.
Nhận xét: mẫu trắng khơng có pic trùng với pic chất phân tích. Điện di đồ mẫu chuẩn và mẫu thử là giống nhau. Khi thêm chất chuẩn Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin vào mẫu thử thì diện tích pic tăng lên. Vậy phƣơng pháp có tính đặc hiệu.
Hình 3.13. Điện di đồ mẫu trắng
Hình 3.14.Điện di đồ mẫu chuẩn 3TC, AZT và NVP
Hình 3.15. Điện di đồ chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP
Hình 3.16. Điện di đồ chế phẩm thêm hỗn hợp chuẩn
3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn
Từ phƣơng trình Si = k1.Ci khi tăng nồng độ chất phân tích thì diện tích pic điện di cũng tăng lên, song lý thuyết chỉ ra rằng tỉ lệ đó chỉ đúng trong một khoảng nhất định. Vì vậy chúng tơi phải khảo sát khoảng tuyến tính của chất phân tích.
Chúng tơi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính trong điều kiện tối ƣu mục 3.1.14 của 3TC, AZT và NVP. Chuẩn bị 6 hỗn hợp dung dịch chuẩn có chứa 3TC nồng độ từ 77,25 µg/ml đến 231,7µg/ml, NVP nồng độ từ 99,25 µg/ml đến 297,7 µg/ml và AZT nồng độ từ 149,0 µg/ml đến 447,0 µg/ml , mỗi nồng độ đƣợc đo lặp lại 3 lần.
Do chế phẩm thuốc có hàm lƣợng dƣợc chất cao nên chúng tôi chọn khoảng nồng
độ nhƣ trên để tiến hành khảo sát lập đƣờng chuẩn.
chúng tôi sử dụng phần mềm Minitab 16 Pro để xây dựng đƣờng chuẩn, kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.3: Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ 3TC tương ứng
Nồng độ (µg/ml) 77,25 123,6 154,5 169,95 185,4 231,7 Diện tích pic
(mAU.s)
29,85 47,60 62,10 70,70 78,76 97,80 Phƣơng trình hồi quy tuyến tính : S = (-6,10 ±5,79) + (0,449 ±0,036)C
250 200 150 100 100 90 80 70 60 50 40 30 20 nong do 3TC(µg/ml) D ie n t ic h 3 TC (m A U .s )
Scatterplot of Dien tich 3TC(mAU.s) vs nong do 3TC(µg/ml)
Hình 3.17.Đường chuẩn biểu thị quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ 3TC
Kết quả bảng phân tích phƣơng sai cho thấy giá trị Pvalue< 0,05 của hằng số a,b < 0,05 chứng tỏ nồng độ 3TC và diện tích 3TC có quan hệ tuyến tính. Trị số P trong kết quả của phƣơng trình hồi quy (chuẩn F) <0,05 cũng chứng tỏ phƣơng trình trên chỉ sai khác giữa lý thuyết.
Theo kết quả trên ta có: a= -6,103 ; b= 0,449; Sa= 2,087; Sb= 0,013. Độ lệch chuẩn của phƣơng trình Sy= 1,504.
Tra bảng chuẩn t với bậc tự do f=4, độ tin cậy 95% có t=2,776 nên phƣơng trình hồi quy đƣờng chuẩn có dạng y= (a± t.Sa) + (b± t. Sb).x
Hay S= (-6,10 ±5,79) + (0,449 ±0,036)C.
Đánh giá phƣơng trình hồi quy của đƣờng chuẩn : Kiểm tra giá trị a với giá trị 0 dựa vào chuẩn thống kê Fisher.
Ft= S‟y2/ Sy2= 5,2477 . F(0,95;3;4)= 6,5914.
Nhƣ vậy Ft< F(0,95;3;4) thì sự khác nhau về phƣơng sai của 2 phƣơng trình khơng có ý nghĩa thống kê. Hay có thể xem a=0 tức là khơng có sai số hệ thống khơng đổi.
Bảng 3.4. Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ AZT tương ứng
Nồng độ (µg/ml) 149,0 238,4 298,0 327,8 357,6 447,0 Diện tích pic (mAU.s) 57,4 94,8 120,6 138,7 149,4 186,5
Phƣơng trình hồi quy tuyến tính : S = (-8,29 ±8,22) + (0,439 ±0,025)C. Hệ số tƣơng quan : r = 0,998 450 400 350 300 250 200 150 200 175 150 125 100 75 50 nong do AZT(µg/ml) D ie n t ic h A ZT ( m A U .s )
Scatterplot of Dien tich AZT (mAU.s) vs nong do AZT(µg/ml)
Hình 3.18. Đường chuẩn biểu thị quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ AZT
Kết quả bảng phân tích phƣơng sai cho thấy giá trị Pvalue< 0,05 của hằng số a,b < 0,05 chứng tỏ nồng độ AZT và diện tích AZT có quan hệ tuyến tính. Trị số P trong kết quả của phƣơng trình hồi quy (chuẩn F) <0,05 cũng chứng tỏ phƣơng trình trên chỉ sai khác giữa lý thuyết.
Theo kết quả trên ta có: a= -8,29 ; b= 0,439; Sa= 2,961; Sb= 0,009. Độ lệch chuẩn
của phƣơng trình Sy= 2,135.
Tra bảng chuẩn t với bậc tự do f=4, độ tin cậy 95% có t=2,776 nên phƣơng trình hồi quy đƣờng chuẩn có dạng y= (a± t.Sa) + (b± t. Sb).x
Hay S= (-8,29 ±8,22) + (0,439 ±0,025)C.
Đánh giá phƣơng trình hồi quy của đƣờng chuẩn : Kiểm tra giá trị a với giá trị 0 dựa vào chuẩn thống kê Fisher.
Thay số vào ta có: Sy2= 3,6781 ; S‟y2
= 18,7884 Ft= S‟y2/ Sy2= 5,108
F(0,95;4;5)= 6,5914
Nhƣ vậy Ft< F(0,95;3;4) thì sự khác nhau về phƣơng sai của 2 phƣơng trình khơng có ý nghĩa thống kê. Hay có thể xem a=0 tức là khơng có sai số hệ thống khơng đổi.
Bảng 3.5. Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ NVP tương ứng
Nồng độ (µg/ml) 99,25 158,8 198,5 218,3 238,2 297,7 Diện tích pic
(mAU.s)
58,6 93,7 119,48 136,7 148,6 188,4 Phƣơng trình hồi quy tuyến tính : S= (-9,05 ±8,36) + (0,661 ±0,039)C.
Hệ số tƣơng quan : r = 0,998 300 250 200 150 100 200 175 150 125 100 75 50 nong do NVP(µg/ml) D ie n t ic h N V P ( m A U .s )
Scatterplot of Dien tich NVP (mAU.s) vs nong do NVP(µg/ml)
Hình 3.19. Đường chuẩn biểu thị quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ NVP
Kết quả bảng phân tích phƣơng sai cho thấy giá trị Pvalue< 0,05 của hằng số a,b < 0,05 chứng tỏ nồng độ AZT và diện tích AZT có quan hệ tuyến tính. Trị số P trong
kết quả của phƣơng trình hồi quy (chuẩn F) <0,05 cũng chứng tỏ phƣơng trình trên chỉ sai khác giữa lý thuyết.
Theo kết quả trên ta có: a= -9,05 ; b= 0,661; Sa= 3,01; Sb= 0,014. Độ lệch chuẩn của phƣơng trình Sy= 2,169.
Tra bảng chuẩn t với bậc tự do f=4, độ tin cậy 95% có t=2,776 nên phƣơng trình hồi quy đƣờng chuẩn có dạng y= (a± t.Sa) + (b± t. Sb).x
Hay S= (-9,05 ±8,36) + (0,661 ±0,039)C.
Đánh giá phƣơng trình hồi quy của đƣờng chuẩn : Kiểm tra giá trị a với giá trị 0 dựa vào chuẩn thống kê Fisher.
Thay số vào ta có: Sy2= 3,7752 ; S‟y2
= 20,4117. Ft= S‟y2/ Sy2= 5,4068.
F(0,95;3;4)= 6,5914
Nhƣ vậy Ft< F(0,95;3;4) thì sự khác nhau về phƣơng sai của 2 phƣơng trình khơng có ý nghĩa thống kê. Hay có thể xem a=0 tức là khơng có sai số hệ thống khơng đổi.
3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)
Theo IUPAC và ISO, LOD đƣợc xem là nồng độ nhỏ nhất mà phƣơng pháp phân tích có thể phát hiện đƣợc. Nhƣ vậy LOD phụ thuộc vào thành phần nền của mẫu phân tích và do đó đƣợc đánh giá cho mỗi loại nền mẫu khác nhau khi sử dụng phƣơng pháp phân tích.
LOQ đƣợc xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Trong các chế phẩm thuốc HIV của các công ty Dƣợc phẩm khác nhau sản xuất, ngoài thành phần các hoạt chất cịn có một lƣợng rất lớn các tá dƣợc khác nhau đi kèm nên chúng tơi khơng thể tìm đƣợc mẫu trắng có thành phần nền nhƣ mẫu thực nhƣng không chứa chất phân tích.Vì vậy chúng tơi tính LOD khi khơng có mẫu trắng là sử dụng độ lệch chuẩn của phƣơng trình hồi quy thay vì sử dụng độ lệch chuẩn đƣờng nền.
LOQ= 10.Sy/b Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.6.Giới hạn phát hiện(LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của đường chuẩn
Chất phân tích Phƣơng trình đƣờng chuẩn Hệ số góc (b) Độ lệch chuẩn (Sy) LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml) 3TC S= -6,10 +0,449.C 0,449 1,50 10.02 33,41 AZT S= -8,29 + 0,439.C 0,439 2,13 14,55 48,52 NVP S= -9,05 + 0,661.C 0,661 2,17 9,85 32,83
3.2.5. Độ lặp lại của phƣơng pháp
Một phƣơng pháp phân tích tốt ngồi việc có sai số nhỏ cịn u cầu có độ lặp lại cao. Để đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại ở 3 nồng độ của 3TC là (77,25; 154,5 và 231,7 µg/ml), của AZT là (149; 298,0 và 447 µg/ml), của NVP là (99,25; 198,5 và 297,7 µg/ml). Mỗi mức nồng độ tiến hành với 5 mẫu độc lập. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng sau
Bảng 3.7. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp MEKC trong định lượng 3TC
Lần tiêm mẫu Diện tích pic ở các mức nồng độ của 3TC
Thấp 77,25µg/ml Trung bình 150µg/ml Cao 231,7 µg/ml 1 29,85 63,51 98,83 2 30,10 62,73 97,85 3 29,54 63,32 98,43 4 29,76 62,86 98,62 5 30,55 62,95 97,95 S pic trung bình 29,96 63,07 98,34 RSD (%) 1,24 0,58 0,43
Bảng 3.8. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp MEKC trong định lượng AZT
Lần tiêm mẫu Diện tích pic ở các mức nồng độ của AZT
Thấp 149 µg/ml Trung bình 298 µg/ml Cao 447 µg/ml 1 57,65 122,35 190,23 2 58,34 120,60 186,56 3 57,40 119,76 187,49 4 58,63 122,57 191,12 5 58,80 122,20 187,32 S pic trung bình 58,16 121,50 188,54 RSD (%) 1,053 1,024 1,061
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp MEKC trong định lượng NVP
Lần tiêm mẫu Diện tích pic ở các mức nồng độ của NVP Thấp 99,25 µg/ml Trung bình 198,5µg/ml Cao 297,7 µg/ml 1 59,70 120,56 190,67 2 58,63 121,34 190,32 3 58,12 119,48 188,44 4 57,45 120,40 189,95 5 59,36 122,87 188,74 S pic trung bình 58,65 120,93 189,62 RSD (%) 1,55 1,05 0,519
Nhận xét: Từ bảng kết quả cho thấy ở cả 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao của