Định lƣợng AFP, HCG, uE3 trong huyết thanh thai phụ đƣợc thực hiện bằng máy Immulite 2000 của hãng Siemen (Mỹ). Nguyên lý định lƣợng ba chất AFP, HCG, uE3 trong huyết thanh mẹ:
- Định lƣợng AFP và HCG bằng phƣơng pháp sandwich (hình 2.2):
Hình 10: Ngun lý phƣơng pháp miễn dịch hố phát quang sandwich [46]
Bƣớc 1: AFP/ HCG của thai trong huyết thanh mẹ gắn với kháng thể đặc hiệu AFP/ HCG.
Bƣớc 2: Bổ sung enzym có gắn gốc hố chất phát quang. Phức hợp kháng thể - AFP/HCG gắn với enzym có gốc phát quang tạo thành phức hợp đặc hiệu: kháng thể - AFP/HCG – enzym gắn gốc hoá chất phát quang.
nồng độ cao
kháng thể kháng nguyên kháng thể gắn chất phát quang nồng độ thấp
Bƣớc 3: Rửa loại hết hoá chất dƣ. Bổ sung dung dịch hiển thị màu, đo mức độ hiển thị màu. Nồng độ AFP/ HCG tỷ lệ thuận với mức độ hiển thị màu.
- Định lƣợng uE3 bằng phƣơng pháp cạnh tranh (competitive) (hình 2.3):
Hình 11: Nguyên lý phƣơng pháp miễn dịch hoá phát quang cạnh tranh [46]
Bước 1: uE3 của thai trong huyết thanh mẹ gắn với kháng thể trên bi.
Bước 2: bổ sung enzym có gắn gốc hố chất phát quang, enzym có gắn chất phát
quang sẽ gắn vào phần kháng thể cịn dƣ trên giá đỡ.
Bước 3: Rửa trơi phần hố chất cịn dƣ, bổ sung dung dịch hiển thị màu, đo mức độ
hiển thị màu. Nồng độ uE3 tỷ lệ nghịch với mức độ hiển thị màu.
Mức độ hiển thị màu đƣợc đo bằng mật độ quang hấp thụ ở ba bƣớc sóng 450nm hay 450/650 nm hay 450/690nm.
Trƣớc khi tiến hành đo định lƣợng mẫu huyết thanh của thai phụ, với mỗi một đợt hóa chất đƣa vào hệ thống định lƣợng, việc thực hiện hai bƣớc chuẩn hóa kỹ thuật là chuẩn adjuster và chuẩn QC (Quallity control).
Chuẩn adjuster là đƣợc chuẩn lại đƣờng biểu thị giữa mật độ quang hấp thụ hay CPS với nồng độ chất đo. Chuẩn adjuster đƣợc thực hiện đo chỉ số CPS của kháng nguyên từng chất cần đo với hai mức nồng độ cao và thấp. Mỗi nồng độ đƣợc đo lặp lại 4 lần, dựa vào sự sai số giữa các lần đo từ đó máy sẽ hiệu chỉnh lại
kháng thể kháng nguyên kháng nguyên và kháng thể gắn chất phát quang nồng độ thấp nồng độ cao
đƣờng cong chuẩn trong máy. Sau khi chuẩn lại chính xác đồ thị đƣờng biểu thị mật độ quang hấp thụ với nồng độ chất đo rồi, cần thiết phải đo lại với mẫu huyết thanh chuẩn để kiểm tra lại đồ thị đã hiệu chỉnh.
Chuẩn QC (Quallity control) là kiểm tra kết quả đo đạc của máy bằng huyết thanh mẫu đã biết chính xác nồng độ các chất. Bƣớc chuẩn này gọi là chuẩn QC (Quallity control) với 3 nồng độ ở ba mức cao, trung bình, thấp đo lặp lại 4 lần. Nếu chuẩn QC chính xác thì đảm bảo đƣợc đo nồng độ huyết thanh bệnh nhân chính xác.