Sắc ký đồ của Rhodamine Bở các cột tách khác nhau

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) xác định rhodamine b trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector UV VIS (Trang 36 - 39)

(a) RP- C18 (b) RP- C8

Dựa vào việc khảo sát sắc ký đồ của Rhodamine B trên các cột RP- C18 và RP- C8 trong những điều kiện như nhau cho ta thấy khả năng tách Rhodamine B trên cột RP- C8 là khá hơn.

Vì vậy cột RP- C8 được lựa chọn để tách và xác định hàm lượng Rhodamine B. Cột RP- C8 được sử dụng có kích thước 4,6mm x150mm, 5m.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 mV Detector A Ch2:576nm 2 .0 8 2 2 .5 3 0 2 .6 9 4

3.3. Tối ƣu hóa pha động

Đây là yếu tố quan trọng sau pha tĩnh, nó quyết định hiệu suất tách sắc ký của mẫu phân tích. Pha động và pha tĩnh là hai yếu tố chính của q trình sắc ký. Hai yếu tố này quyết định thời gian lưu giữ chất và hiệu quả tách. Khác với pha tĩnh, pha động là một yếu tố linh động, có thể thay đổi dễ dàng để được điều kiện phân tích tối ưu. Do đó sau khi chọn cột pha tĩnh thì thành phần pha động là yếu tố tiếp theo được khảo sát. Trên cơ sở tổng quan tài liệu thì có hai pha động được chọn là:

Pha động thứ nhất:

MeOH – nước (được điều chỉnh tới pH= 3 bởi axit HCOOH).

Pha động thứ hai:

ACN- nước (được điều chỉnh tới pH = 3 bởi axit HCOOH, có thêm 5mM natri 1- heptansunfonat).

3.3.1. Ảnh hƣởng của thành phần pha động tới khả năng tách sắc ký

Tỷ lệ thành phần dung mơi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột tách. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động thay đổi, tức là làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích, và do đó làm thay đổi hệ số dung lượng của chất phân tích.

Do đó, để có được một thành phần pha động phù hợp thì cần tiến hành khảo sát các tỷ lệ khác nhau với các thành phần pha động đã lựa chọn gồm: Pha động thứ nhất:

Dung dịch đệm có pH=3 và dung mơi hữu cơ methanol (MeOH), thay đổi

tỷ lệ pha động: 60%MeOH- 40% H2O; 65%MeOH- 35% H2O; 70%MeOH- 30%

H2O; 75%MeOH- 25% H2O; 80%MeOH- 20% H2O; 85%MeOH- 15% H2O; 90%MeOH- 10% H2O; 95%MeOH- 5% H2O; 100%MeOH- 0% H2O.

Pha động thứ hai:

ACN- nước được điều chỉnh tới pH=3 bởi axit HCOOH, có thêm 0,005M natri 1- heptansunfonat, thay đổi tỷ lệ pha động: 60%ACN- 40% H2O;

65%ACN- 35% H2O; 70%ACN- 30% H2O; 75%ACN- 25% H2O; 80%ACN-

20% H2O; 85%ACN- 15% H2O; 90%ACN- 10% H2O; 95%ACN- 5% H2O;

100%ACN- 0% H2O.

Tiến hành lần lượt đối với từng pha động như sau:

3.3.1.1. Pha động thứ nhất

Pha tĩnh: cột RP- C8, 5m, 4,6mm x 150mm

Nhiệt độ cột tách: 250

C

Nồng độ rhodamine B: 2,0ppm Bước sóng của detector: 550nm pH của dung dịch đệm: 3

Nồng độ của dung địch đệm: 20mM

Tốc độ của pha động: 0,8ml/phút, thành phần như trong bảng 3.3.

Sau khi chạy sắc ký, dựa vào thời gian lưu của rhodamine B, thiết lập được mối quan hệ giữa hệ số lưu của rhodamine B vào tỷ lệ thành phần pha động của pha động thứ nhất .

Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.3 và hình 3.5.

Bảng 3.3. Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động

STT %MeOH %H2O tR0(s) tRi(s) ki=(tRi- tR0)/tR0

1 60 40 2,11 11,812 4,598

2 65 35 2,11 6,476 2,069

4 75 25 2,11 4,640 0.890 5 80 20 2,11 3,522 0,669 6 85 15 2,11 2,808 0,331 7 90 10 2,11 2,701 0,280 8 95 5 2,11 2,722 0,290 9 100 0 2,11 2,514 0,191 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500 5.000 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 100.0 Tỷ lệ MeOH(%) k'

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) xác định rhodamine b trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector UV VIS (Trang 36 - 39)