1.3. Một số phƣơng pháp phân tích cơng cụ trong phân tích tồn dƣ kháng sinh
1.3.2.5 Detector khối phổ (Mass Spectrometry) [15, 17]
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa,... Các ion tạo thành này đƣợc tách theo tỉ số m/z, từ đó có thể cho thơng tin về khối lƣợng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất.
Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và detector. Trƣớc hết, các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồn ion, sau đó đƣa
vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín hiệu thu đƣợc sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lƣu trữ.
*/ Nguồn ion
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ đƣợc dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và đƣợc ion hóa. Một số kĩ thuật ion hóa đƣợc sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ nhƣ: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI), ion hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment – FAB). Dƣới đây là phƣơng pháp ion hóa đƣợc sử dụng trên thiết bị khối phổ mà chúng tôi nghiên cứu:
Ion hóa phun điện tử – ESI
Kĩ thuật này chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí. Dung dịch mẫu đƣợc dẫn vào vùng có trƣờng điện từ mạnh đƣợc duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ. Các giọt nhỏ trƣớc khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ đƣợc kết hợp với dịng khí khơ để làm bay hơi dung mơi. Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dƣơng và ion âm.
Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất không phân cực nhƣ: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol,... và các chất phân cực có khối lƣợng phân tử nhỏ.
*/ Bộ phận phân tích khối lƣợng
a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)
Tứ cực đƣợc cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua. Một trƣờng điện từ đƣợc tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực đƣợc đóng vai trị nhƣ một bộ lọc khối. Khi một trƣờng điện từ đƣợc áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trƣờng RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua đƣợc bộ lọc này.
b) Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)
Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dƣới. Trái với loại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đƣờng cong ổn định đƣợc bẫy lại cho đến khi một điện áp RF đƣợc đặt trên điện cực vòng. Các ion khác nhau m/z sau đó trở nên khơng ổn định và sẽ có hƣớng đi về phía detector. Do điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu đƣợc một phổ khối lƣợng đầy đủ.
Các ion tồn tại trong bẫy có thể đƣợc chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu đƣợc các mảnh ion con, từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần). Về nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu có thể thực hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thƣờng chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần.
c) Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser)
Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lƣợng. Do các ion có cùng năng lƣợng nhƣng lại khác nhau về khối lƣợng
nên thời gian đi tới detector sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do có vận tốc lớn hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này đƣợc gọi là thiết bị phân tích thời gian bay do tỉ số m/z đƣợc xác định bởi thời gian bay của các ion. Thời gian bay của một ion tới detector phụ thuộc vào khối lƣợng, điện tích và năng lƣợng động học của các ion. Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp nhƣng nó có ƣu điểm là khối lƣợng ion có thể phân tích khơng bị hạn chế.
*/ Bộ phận phát hiện
Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lƣợng, các ion đƣợc đƣa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc khuếch đại hoặc tạo ra một dịng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.
Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó đƣợc dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron.
Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống nhƣ thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phơtpho và giải phóng ra các photon. Các photon này đƣợc phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động nhƣ thiết bị nhân electron. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là các ống nhân quang đƣợc đặt trong chân không nên loại bỏ đƣợc các khả năng nhiễm bẩn.