Tỉ lệ pha động MeOH:CH3COOH
0,1% (v/v)
Cƣờng độ tín
hiệu (cps) Thời gian lƣu Đặc điểm pic
CAP FF CAP FF
30:50 24 30 - - Tín hiệu đƣờng nền 50:50 280 2224 8,33 1,83 Không rõ pic 60:40 944 3444 9,30 4,66 Pic doãng và rất xấu
70:30 2272 6532 3,70 2,44 Hai pic đã tách khỏi nhau, đầu pic còn chẻ nhiều.
80:20 2888 1,1e4 2,82 2,29 Hai pic tách khỏi nhau, đầu pic chẻ ít.
90:10 1,5e4 6,5e4 1,35 1,29 Hai pic nhọn nhƣng không tách khỏi nhau Nhƣ vậy khi càng tăng tỉ lệ MeOH đồng nghĩa với độ phân cực giảm đi (vì CH3COOH có độ phân cực cao hơn MeOH) thì tín hiệu pic ra càng tốt, nghĩa là khả năng hịa tan của nhóm phenicol trong dung mơi phân cực vừa nhƣ MeOH tốt hơn rất nhiều. Khi tỉ lệ MeOH:CH3COOH là 90:10 (v/v) thì tín hiệu là tốt nhất, tuy nhiên do lúc này cả hai chất CAP và FF đều bị hòa tan mạnh nhƣ nhau dẫn tới tốc độ di chuyển của chúng trong pha động là giống nhau và không tách ra khỏi nhau, hơn nữa thời gian lƣu ở đây nhỏ - chất phân tích ra sớm dễ bị ảnh hƣởng bởi tạp chất . Ở tỉ lệ MeOH thấp thì khả năng hòa tan của CAP và FF có sự khác nhau rõ rệt, dẫn tới chúng dễ dàng tách ra khỏi nhau nhƣng tín hiệu pic lại thấp và pic rất xấu, đồng thời thời gian lƣu tăng lên gây tốn dung môi và tăng thời gian phân tích. Theo kết quả trên chỉ có tỉ lệ 80% dung mơi MeOH có thể tạm chấp nhận đƣợc.
c/ Chƣơng trình Gradient
Nhƣ trên ta thấy nếu chạy với tỉ lệ pha động cố định (theo tối ƣu ở trên là MeOH:CH3COOH 0,1% = 80:20) thì không thể vừa cho thời gian lƣu phù hợp mà lại vừa cho tín hiệu cao và pic đẹp. Do đó để kiểm sốt thời gian lƣu sao cho các chất đi ra ở giữa sắc đồ (trong khoảng thời gian khảo sát 10 phút cho một sắc đồ), nghĩa là tỉ lệ dung môi khảo sát tăng dần MeOH và đạt 100% trong khoảng thời gian từ 4 đến 6 phút, sau đó sẽ giảm dần tỉ lệ MeOH xuống, đồng thời với thời gian nhƣ vậy, các tạp chất đƣợc loại ở thời gian đầu và thời gian cuối của sắc đồ giúp giảm thiểu đƣợc nhiễm chéo khi chạy các mẫu liên tục. Và với chế độ chạy nhƣ vậy
tỉ lệ 2 kênh sử dụng là tƣơng đƣơng nhau, giảm lƣợng dung môi MeOH xuống so với trƣờng hợp ta chọn chế độ cố định với tỉ lệ 80% MeOH.
Trên cơ sở lập luận trên chúng tôi khảo sát pha động theo một số chƣơng trình gradient (đẳng dòng 0,4ml/phút) và tối ƣu đƣợc nhƣ bảng sau:
Bảng 3.7 Chương trình gradient tối ưu cho pha động phân tích CAP và FF
Thời gian (phút) Kênh B: MeOH Kênh A: CH3COOH 0,1%
0,01 20 80
4 100 0
6 100 0
6,01 20 80
Chƣơng trình gradient trên cho sắc đồ nhƣ sau:
Hình 3.13 Sắc đồ các 2 mảnh ion con định lượng của FF và CAP (lần lượt theo thứ tự từ trái sang phải) khi chạy chương trình gradient ở bảng 3.7
Sắc đồ trên cho thấy hai pic đã tách khỏi nhau hồn tồn, tín hiệu khá cao, pic nhọn, đẹp.
d/ Tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng cũng là một yếu tố ảnh hƣởng lên quá trình phân tách, thời gian lƣu của các chất. Và nó cũng là một yếu tố ảnh hƣởng tới áp lực đầu cột tách. Đối với máy sắc ký khối phổ mà chúng tôi nghiên cứu, tốc độ dòng khi cho qua cột thƣờng đƣợc khuyến cáo sao cho áp suất đầu cột không đƣợc vƣợt quá 500 bar và thơng thƣờng dịng tổng ≤ 0,5ml/phút
Theo hệ pha động và chƣơng trình gradient trên với tốc độ dòng tổng 4ml/phút, sắc đồ và tín hiệu đã ổn định và khá đẹp.
Tuy nhiên chúng tôi thử tiến hành khảo sát chƣơng trình gradient trên ở những tốc độ dịng khác nhau để tối ƣu hóa tối đa các yếu tố. Tiến hành khảo sát tốc độ dòng lần lƣợt là 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml/phút chúng tôi thu đƣợc các sắc đồ nhƣ sau:
Hình 3.14 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,2mL/phút
Hình 3.15 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,3mL/phút
Hình 3.16 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,4mL/phút
Hình 3.17 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,5mL/phút
Kết quả khảo sát đƣợc tổng hợp trong bảng sau:
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động
Tốc độ dịng (ml/phút)
Cƣờng độ tín hiệu (cps) Thời gian lƣu (phút)
CAP FF CAP FF
0,2 3368 7696 8,19 7,5
0,3 1324 6100 6,50 5,9
0,4 2144 5000 5,93 5,3
0,5 1556 3632 5,73 5,05
Ta thấy khi tăng tốc độ dòng thì thời gian lƣu giảm đi, nhƣng đồng thời tín hiệu cũng giảm đi tƣơng đối (trừ trƣờng hợp tín hiệu của CAP khi tốc độ dòng là 0,3 ml/phút). Theo bảng kết quả trên để có thời gian lƣu phù hợp và tín hiệu tƣơng đối rõ chúng tơi vẫn chọn tốc độ dịng tối ƣu là 0,4 mL/phút.
Từ các kết quả khảo sát về điều kiện chạy máy LC/MS/MS chúng tôi đƣa ra các thông số điều kiện tối ƣu cho phân tích CAP và FF nhƣ sau:
Cột Symestry C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm).
Thành phần pha động: Kênh A là dung dịch acid axetic 0,1% trong nước, kênh B là dung mơi MeOH.
Chương trình chạy gradient ở bảng 3.7.
Tốc độ dòng 0,4ml/phút.
Detector MS/MS với các thông số ở bảng 3.1 và 3.3.
Các kết quả tối ƣu trên đƣợc chúng tôi áp dụng khi chạy các khảo sát về điều kiện tách chiết, xử lý mẫu và đánh giá phƣơng pháp.
3.2. Đánh giá phƣơng pháp
3.2.1 Khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn
Lập đƣờng chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phƣơng pháp phân tích. Từ đƣờng chuẩn ta có thể biết đƣợc khoảng tuyến tính của chất phân tích, từ đó đƣa nồng độ mẫu thực nằm trong khoảng tuyến tính. Nhƣ ở chƣơng 2 đã nói tới do CAP cần phải kiểm soát nồng độ sao cho tiến về mức 0, còn FF lại ở mức 200ppb (cao hơn rất nhiều lần so với CAP) đồng thời các mẫu tồn dƣ nếu có FF thƣờng ở mức cao, nhƣng mặt khác theo các kết quả khảo sát ở 3.1 ta thấy tín hiệu đáp ứng của FF với máy cao hơn là CAP khi ở cùng nồng độ (khoảng 2 đến 5 lần). Tuy nhiên so với sự chênh lệch về giá trị MRL cần kiểm sốt thì nó là khơng đáng kể. Vì vậy để có thể phân tích đồng thời hai chất trên, chúng tôi đã tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn trong khoảng sau: pha một dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ từ 0,05 đến 3ppb đối với CAP và từ 5 đến 300ppb đối với FF từ dung dịch chuẩn trung gian 1ppm. Các dung dịch chuẩn đƣợc pha trong Methanol. Sau đó đem đo trong điều kiện đã tối ƣu ở 3.1, kết quả thu đƣợc ở bảng sau
Bảng 3.9 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Phenicol
Nồng độ CAP
(ppb) Diện tích pic Nồng độ FF (ppb) Diện tích pic
0,05 1324 5 153000 0,10 2030 10 285000 0,20 3430 20 586000 0,50 8540 50 1350000 1,00 15200 100 2730000 2,00 32200 200 5310000 3,00 47100 300 7360000
Các dữ liệu trên xử lý trên phần mềm Excel chúng tôi thu đƣợc đồ thị sau:
Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ CAP
y = 6E-05x - 0.0256 R2 = 0.9994 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 10000 20000 30000 40000 50000 Diện tích pic N ồ n g đ ộ
Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ FF y = 4E-05x - 4.1512 R2 = 0.9973 0 50 100 150 200 250 300 350 0 100000 0 200000 0 300000 0 400000 0 500000 0 600000 0 700000 0 800000 0 Diện tích N ồn g độ
Nhƣ vậy với hai chuẩn CAP và FF của nhóm phenicol trong khoảng nồng độ chúng tơi khảo sát đều tuyến tính. Do đó hai đồ thị trên cũng chính là đƣờng chuẩn của CAP và FF, khoảng nồng độ chúng tôi khảo sát ở trên là tuyến tính và đƣợc áp dụng cho các khảo sát khác.
Tuy nhiên trong quá trình khảo sát tiếp theo, ở những mức thêm chuẩn khác nhau, chúng tôi sẽ sử dụng kết quả trên để lập đƣờng chuẩn trong những khoảng nhỏ hơn phù hợp với nồng độ thêm chuẩn trên nền mẫu.
3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp pháp
Để xác định giới hạn phát hiện, chúng tôi dùng chuẩn hỗn hợp CAP và FF 2ppb rồi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu thực (cũng là mẫu trắng khơng chứa chất phân tích) để nồng độ cuối cùng (sau khi qua tất cả các bƣớc xử lý mẫu) thu đƣợc ở các mức khác nhau (và <2ppb). Tiến hành đo chất phân tích thu đƣợc sắc đồ. Từ sắc đồ chúng tơi đo tỉ số tín hiệu/nhiễu.
Trong nghiên cứu này, chúng tơi xác định LOD dựa trên tỉ số tín hiệu/nhiễu
(S/N). Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích; N là nhiễu đƣờng nền
LOD đƣợc chấp nhận là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu đƣờng nền (S/N=3).
Cũng theo phƣơng pháp này LOQ đƣợc chấp nhận là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đƣờng nền (S/N = 10)
Nhƣ vậy LOQ = 3,3 LOD
Hình 3.18 Sắc đồ hai mảnh định lượngcủa CAP và FF thêm chuẩn trên nền mẫu trắng phương pháp với nồng độ 0,03 ng/ml
Theo sắc đồ trên: - Với CAP: S/N = 2H/h = 68x2/40 = 3,4 - Với FF: S/N = 2H/h = 240x2/50 = 9,6
Vậy sắc đồ trên tƣơng ứng với LOD của CAP và LOQ của FF. Từ kết quả này có thể thấy giới hạn phát hiện (LOD) của phƣơng pháp đối với CAP là 0,03 ng/ml tƣơng ứng với giới hạn định lƣợng LOQ = 0,03x3,3 = 0,1ng/ml.
Giới hạn định lƣợng đối với FF = 0,03ng/ml tƣơng ứng cho giới hạn phát hiện LOD=LOQ/3,3 = 0,01ng/ml.
Tính tốn theo 2.2.5.e, ta thu đƣợc giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp trên nền mẫu thực (ng chất phan tích/g mẫu thực) nhƣ sau:
CAP : LOD 0,009ng/g; LOQ 0,03ng/g FF: LOD 0,003ng/g; LOQ 0,009ng/g
3.2.3 Độ chính xác của phép đo
Theo ISO, độ chính xác của phép đo đƣợc đánh giá qua độ đúng và độ chụm. Độ chụm là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực. Độ đúng đƣợc biểu diễn dƣới dạng sai số tuyệt đối hoặc sai số tƣơng đối.
Sai số đƣợc tính theo cơng thức:
% 100 % t t i S S S X n X X n i i tb 1 % %
Trong đó: %X : Sai số phần trăm tƣơng đối.
Si : giá trị diện tích pic đo đƣợc.
St : giá trị diện tích pic tìm đƣợc theo đƣờng chuẩn. N : số lần đo.
Độ lặp lại của phép đo đƣợc xác định theo các đại lƣợng S2 và CV.
2 S 1 ) ( 2 n S Si tb 100 tb S S CV Trong đó: Stb : Diện tích pic trung bình.
N : số lần đo. S : độ lệch chuẩn.
CV : hệ số biến động của phép đo.
Để đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo ta dựng đƣờng chuẩn, pha 3 mẫu có nồng độ ở điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính, mỗi mẫu đo lặp lại 4 lần với các điều kiện đã tối ƣu ở 3.1. Các kết quả đƣợc chỉ ra trong bảng dƣới đây
Bảng 3.10 Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau
Nồng độ (ppb) Diện tích pic X% CV Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 St CAP 0,1 2030 2100 2080 2050 2093 1,50 1,51 1 16200 16100 16300 17200 17093 4,07 3,08 3 48100 50200 49100 50300 50426 1,98 2,10 FF 10 335000 346000 378000 325000 353780 5,62 6,65 100 2720000 2690000 2730000 2720000 2603780 4,27 0,64 300 7360000 7350000 7370000 7360000 7603780 3,21 0,11 Nhận xét: Phần trăm sai số và hệ số biến thiên CV của phép đo tại 3 mức nồng độ 10ppb, 100ppb và 300ppb đối với FF và 0,1; 1; 3 có giá trị từ 1,2 – 7,6% đều nằm trong giới hạn cho phép của AOAC.
3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi
Đây là hai yếu tố quan trọng đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp phân tích. Để tiến hành xác định hai yếu tố này, chúng tôi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu
mức nồng độ đối với mỗi chất nhƣ sau: 0,5; 1; 2ppb đối với CAP và 10; 100; 200ppb đối với FF (đây là nồng độ cuối cùng trong phần dung dịch rửa giải đƣợc sau khi qua cột SPE). Mỗi mức chúng tôi tiến hành làm lặp lại 6 lần. Độ thu hồi và độ lặp lại đƣợc xác định nhƣ sau:
Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định theo các đại lƣợng S2 và CV.
2 S 1 ) ( 2 n S Si tb 100 tb S S CV Trong đó: Stb : Diện tích pic trung bình. N : số lần đo.
S : độ lệch chuẩn.
CV : hệ số biến động của phép đo.
Độ thu hồi của phƣơng pháp theo các công thức sau :
m V C C '. ( ) 100 c m c m m m C C R Trong đó: C: nồng độ phenicol xác định đƣợc (ng/g) C’: nồng độ phenicol tính từ đƣờng chuẩn (ng/ml) V: thể tích rửa giải (V=3ml) m: khối lƣợng mẫu (g)
Cm+c : nồng độ phenicol xác định đƣợc trong mẫu thêm chuẩn (ng/g)
Cm: nồng độ phenicol có trong mẫu (ng/g) mc: lƣợng phenicol thêm vào (ng)
Trong nghiên cứu này, mẫu trắng đƣợc tiến hành lặp lại nhiều lần và chỉ cho tín hiệu đƣờng nền nên chúng tơi coi nhƣ nồng độ phenicol trong mẫu bằng 0, các tính tốn đƣợc đơn giản hơn nhƣ sau: R% = Spic/Sst (trong đó Spic là diện tích pic xác định đƣợc của mẫu thêm chuẩn theo sắc đồ, Sst là diện tích pic của chuẩn cũng tại nồng độ đó đƣợc tính theo đƣờng chuẩn)
Sử dụng phần mềm Excel và Minitab chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ bảng sau:
Bảng 3.11 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp ở các mức nồng độ khác nhau
Thí nghiệm
lặp
Diện tích pic CAP Diện tích pic FF
0,5ppb 1ppb 2ppb 10ppb 100ppb 200ppb Lần 1 8560 15700 27100 345000 2660000 4900000 Lần 2 8580 15000 27800 330000 2640000 4920000 Lần 3 8950 16600 29500 322000 2770000 5110000 Lần 4 8730 16100 28300 305000 2680000 5000000 Lần 5 8570 15000 27500 313000 2660000 5100000 Lần 6 8750 16200 27900 320000 2700000 4970000 Sst 8760 17093 33760 353780 2603780 5103780 Rtb% 99,2 92,2 83,0 91,2 103,1 102,1 CV 1,75 4,18 2,96 4,31 1,73 1,78
Kết quả độ thu hồi Rtb% ở 3 mức nồng độ với mỗi chất đều cao hơn 83%, nằm trong giới hạn cho phép của AOAC. Độ lặp lại CV(%) khá tốt, nhỏ hơn 4,31%.
Nhƣ vậy, thông qua việc phân tích các mẫu thực trắng thêm chuẩn CAP và FF, các thông số về độ thu hồi, độ lặp lại, khoảng tuyến tính và độ chính xác của phép đo, cùng với giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp cho thấy phƣơng pháp đảm bảo khả năng phát hiện và định lƣợng hai hợp chất CAP và FF trong đối tƣợng thịt (cơ) tƣơi sống. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là khá tốt (CAP là 0,03 và FF là 0,01) dƣới mức tiêu chuẩn cho phép của EU (quy định với thuốc thú y bị cấm nhƣ Chloramphenicol) về giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (0,3ppb đối với CAP).
Do đó có thể áp dụng phƣơng pháp để tiến hành định lƣợng CAP và FF trong các mẫu thực tế
3.3 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu
3.3.1 Lựa chọn nền mẫu cho khảo sát phƣơng pháp và xử lý mẫu sơ bộ
Đối tƣợng trong luận văn chúng tôi nghiên cứu là các mẫu thịt tƣơi sống bao gồm gà, lơn, cá, tôm. Về thành phần cơ bản của các mẫu cơ trên những đối tƣợng mẫu này, theo kết quả phân tích (tại phịng thí nghiệm phân tích thức ăn chăn ni – trƣờng Đại học Nông nghiệp) và một số tài liệu tham khảo chúng tơi có bảng kết quả sau:
Bảng 3.12 Một số thành phần cơ bản của đối tượng mẫu phân tích