Tình hình mắc bệnh TCC do RV trên thế giới và Việt Nam

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.4. TÌNH HÌNH MẮC BỆNH TCC VÀ VẮC XIN PHÒNG NGỪA BỆNH TCC DO

1.4.3. Tình hình mắc bệnh TCC do RV trên thế giới và Việt Nam

1.4.3.1. Tình hình mắc bệnh do RV trên thế giới

RV là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh TCC ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ dƣới 5 tuổi trên tồn thế giới. Theo ƣớc tính chiếm khoảng 40% tất cả các trƣờng hợp TCC ở trẻ em [64]. Khoảng 527.000 bệnh nhân tử vong mỗi năm (từ 475.000 đến 580.000 trƣờng hợp tử vong), hẩu hết ở trẻ em dƣới 2 tuổi [65], chủ yếu là miền nam và Đông nam Châu Á, Châu Phi cận Sahara, với gần 100.000 ca tử vong mỗi năm ở Ấn Độ và hơn 200.000 bệnh nhân tử vong ở các nƣớc Châu Phi [58]. Chƣơng trình giám sát dịch tễ thực hiện tại Châu Á gổm 14 quốc gia hợp tác với PATH, WHO, Trung tâm kiểm sốt và phịng ngừa dịch bệnh (CDC) tại Atlanta, GA (Mỹ) ƣớc tính có khoảng 73% trẻ em nhập viện do TCC ở Hàn Quốc dƣơng tính với RV, Nhật Bản (58%), Myanma (53%), Trung Quốc (46%), Thái Lan (43%), Hong Kong (30%) [57, 66, 71, 72].

Trƣớc khi vắc xin ra đời, tiêu chảy do RV ƣớc tính tại Mỹ có khoảng hơn 50.000 bệnh nhân phải nhập viện và có từ 20 đến 40 ca tử vong mỗi năm. Tại Châu Á sự ra

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy

đời của vắc xin đã ngăn chặn khoảng 110.000 ngƣời chết mỗi năm, giảm 1.400.000 bệnh nhân phải nhập viện và 7.700.000 bệnh nhân khám ngoại trú [29].

Hình 5. Sự phân bố số bệnh nhân tử vong theo khu vực trên thế giới và số bệnh nhân tử vong tại các quốc gia Châu Á [33]

1.4.3.2. Tình hình mắc bệnh do RV tại Việt Nam

Theo kết quả giám sát tại Việt Nam của một nhóm tác giả khác từ năm 1981 đến 1985 tỷ lệ mẫu nghiên cứu dƣơng tính với RV chiếm 26,5%. Theo kết quả giám sát của

Các nước Châu Á khác Ấn Độ SriLanka Hàn Quốc Thái Lan Việt Nam Philippines Trung Quốc Châu Phi Mỹ và Canada Mỹ LaTinh Châu Âu Châu Á

Luận văn th¹c sÜ Phạm Thị Thu Thủy

Trung Tâm Nghiên cứn, sản xuất vắc xin và Sinh Phẩm Y tế trong 11 năm từ 1998 đến 2009 tỷ lệ mẫu dƣơng tính chiếm tới 57,96%, gấp 2 lần so với kết quả nghiên cứu trƣớc đó. Nhƣ vậy, trong những năm gần đây tỷ lệ trẻ nhiễm RV có xu hƣớng tăng mạnh và là nguyên nhân hàng đầu gây TCC tại Việt Nam.

1.4.4. Tình hình sử dụng vắc xin phịng ngừa bệnh TCC do RV

1.4.4.1. Các chủng RV được cân nhắc để phát triển vắc xin

Bệnh viêm dạ dày ruột do RV là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến căn bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ trên tồn thế giới. Hiện nay chƣa có biện pháp hiệu quả nào để thanh tốn hồn tồn bệnh do nhiễm RV hay sự lây truyền của nó. Điều đó cho thấy tầm quan trọng của việc phát triển các văcxin ngăn chặn căn bệnh này. Các chủng RV của ngƣời và động vật đƣợc cân nhắc sử dụng nhƣ các nhà tài trợ gen để phát triển văcxin đƣợc đề cập tới ở bảng sau:

Bảng 5. Các chủng RV đƣợc cân nhắc để phát triển vắc xin [10]

Chủng virut Kiểu hình

Virut rota ở bò, WC3 G6P5

Virut rota ở ngƣời:

W179 G1P8

SC2 G2P6

W178 G3P8

WI61 G9P8

Tạo các chủng mới từ việc sắp xếp lại gen của chủng WC3 (Các gen RV ngƣời đã đƣợc thay thế):

W 179- 9 ( 9 từ W179) G1P5 SC2 - 9 ( 9 từ SC2) G2P5 D7A (1,3,5 - 9 từ SC2) G2P5 WC3 (2-5) ( 1,6 - 11 từ W178) G3P5 W178 - 8 ( 8 từ W178) G3P5 W179 - 4 ( 4 từ W 179) G6P8 WI61 - 4( 4 từ WI61) G6P8 W179 (4, 1,9) ( 4,1,9 từ W179) G1P8

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy

Những nghiên cứu nhằm phát triển một văcxin RV an toàn và hiệu quả đã bắt đầu từ giữa những năm 1970 . Bệnh do RV thƣờng liên quan đến nhiễm trùng biểu mô đƣờng ruột, do vậy việc phát triển văcxin bảo vệ là q trình tìm ra kháng ngun có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với virut. Ngƣời ta đã hy vọng rằng một văcxin RV sống, giảm độc lực sẽ là văcxin hiệu quả nhất.

1.4.4.2. Các loại văc xin được nghiên cứu và sử dụng a. Các loại vắc xin trên thế giới

Ứng cử viên văcxin RV đầu tiên là các văcxin đơn giá "Monovalent vaccines" sử dụng chủng virut rota WC3 đƣợc phân lập từ vật chủ là bò hoặc từ khỉ Rhesus. Đây là loại văcxin sống giảm độc uống một liều duy nhất. Văcxin này an tồn và có thể ngăn chặn đƣợc bệnh tiêu chảy do RV ở trẻ em [10] .

Văcxin thứ hai là các văcxin đa giá "Multivalent vaccines" đƣợc sản xuất năm 1985 bằng cách sử dụng sự thay thế gen [10]. Một gen trong hệ gen của chủng RV động vật đƣợc thay thế bởi gen của RV ngƣời, gen này mã hoá cho protein VP7.

Rota Shield là vacxin tứ liên "Tetravalent vaccines" đƣợc phát triển bởi chủng virut rota MMU18006, là văcxin sống giảm độc lực uống đƣợc sản xuất từ chủng RV ở khỉ Rherus ( RRV - TV). Vacxin này đƣợc cấp phép tháng 10 năm 1998 tại Mỹ, 600.000 trẻ đƣợc sử dụng vắc xin tƣơng đƣơng với 1,2 triệu liều. Văcxin này bị đình chỉ sử dụng vì có liên quan đến tăng nguy cơ lồng ruột sau 3 tuần sử dụng liều đầu tiên với tỷ lệ ƣớc tính 1/10.000 liều.

Vắc xin giịng sơ sinh [10], bác sĩ Ruth Bishop đã phát triển chủng này trong phịng thí nghiệm của bà. Chủng này là chủng RV ngƣời (G3, P6) đƣợc phân lập từ một trẻ sơ sinh và làm giảm độc lực qua nhiều lần cấy truyền. Vắc xin này có thể tạo ra khả năng phòng bệnh đồng týp chống lại giòng G1.

Vắc xin đƣợc tạo ra trong phịng thí nghiệm nghiên cứu của Merck [51], Văcxin phối hợp dựa trên chủng của ngƣời và bò (WC) tạo ra khả năng phòng chống bệnh rất tốt (70%) và phòng bệnh tiêu chảy cấp nặng (95-100%). Văcxin này là văcxin 5 týp phối hợp chủng của ngƣời (G1, G2, G3, G4 và P1(8) và chủng của bò(WC3).

Lun vn thc s Phạm Thị Thu Thy

Vc xin của hãng Glaxo Smith Kline [51], bác sĩ Georges Thiry đƣa ra những kế hoạch về phát triển văcxin rota của hãng này, ứng cử viên của họ là chủng G1P8. Hiện nay văcxin này đã đƣợc cấp phép sử dụng tại Mexico. Vắc xin này đã đƣợc thử thực địa tại Singapore, sử dụng 2 liều vào tháng tuổi thứ 2 và 3 của trẻ. Với thời gian sử dụng văcxin này tránh tăng nguy cơ lồng ruột của trẻ và những tác dụng phụ khác.

b. Vắc xin rota đã được phê chuẩn sử dụng

Hội nghị về virut rota quốc tế lần thứ 6 đƣợc tổ chức ngày 7, 8 tháng 1 năm 2005 tại Mexico đã thông qua và phê chuẩn 2 vắc xin Rota đó là vắc xin RotaTeq của Meck và vắc xin Rotarix của Smith Line, cả hai vắc xin này đã đƣợc WHO phê chuẩn cho sử dụng tháng 1/2006 [10].

Rota Teq là văcxin sống uống giảm độc lực sử dụng 3 liều đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ 1991. Nó là văcxin phối hợp giữa chủng rota của ngƣời và bò, chứa 5 kháng nguyên G1, G2, G3, G4 và P1. Thực địa lâm sàng chỉ ra rằng vacxin này rất an tồn và hiệu lực, nó phịng đƣợc >70% sự xâm nhập của bất kỳ týp RV nào.

Rotarix là văcxin sống giảm độc lực đƣợc sử dụng 2 liều, có nguồn gốc từ 1 chủng RV ngƣời G1P8. Kết quả thử nghiệm cho thấy khoảng 73% phòng đƣợc viêm dạ dày ruột do bất kỳ týp RV nào và > 90% chống lại nhiễm cấp tính do RV và đặc biệt văcxin này có hiệu lực phịng bệnh >83% do RV khơng phải do týp G1, khơng có dấu hiệu chỉ ra rằng lồng ruột ở trẻ em liên quan đến việc sử dụng văcxin này.

c. Vắc xin sản xuất tại Việt Nam

Vắc xin Rotavin-M1 sản xuất từ chủng G1P[8] – WS (KH0118) đƣợc phân lập tại Việt Nam đã đƣợc sản xuất và thử nghiệm lâm sàng trên 30 ngƣời lớn khỏe mạnh [1], thời gian từ 8/2009 đến 10/2009, và trên 799 trẻ khỏe mạnh từ 6-12 tuần tuổi (thời gian từ 04/2010 đến 12/2011) [16], kết quả thu đƣợc là đạt yêu cầu về mức độ an toàn trên ngƣời lớn và trẻ từ 6 – 12 tuần tuổi.

LuËn văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy

2. CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tƣợng nghiên cứu là những trẻ em thỏa mãn các tiêu chí sau: - Độ tuổi từ 0 – 59 tháng tuổi (< 5 tuổi)

- Nhập viện với nguyên nhân TCC: đi ngoài ≥ 3 lần trong ngày (24h), phân lỏng, không máu

- Khởi bệnh ≤ 7 ngày.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

2.2.1.1. Thời gian giám sát

Nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 1/2010 đến tháng 12/2010 tại 3 địa điểm trong cả nƣớc

2.2.1.2. Địa điểm giám sát

Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại 3 bệnh viện đại diện cho 3 miền trong cả nƣớc, việc thu mẫu đƣợc thực hiện bởi các cán bộ địa phƣơng có kinh nghiệm về giám sát dịch tễ và có khả năng thu thập số liệu bệnh nhân và mẫu bệnh phẩm. Những kết quả giám sát điểm tại các bệnh viện là cơ sở để các nhà dịch tễ học phân tích và đánh giá ảnh hƣởng của RV tới cộng đồng.

Ba bệnh viện đƣợc chọn đại diện cho 3 miền thuộc các khu vực khác nhau tại Việt Nam năm 2010 là:

 Miền Bắc: Bệnh viện Nhi Trung Ƣơng

 Miền Trung: Bệnh viện Nhi Khánh Hòa

Luận vn thc s Phạm Thị Thu Thy

2.2.1.3. Quy trình thực hiện

Các mẫu phân của trẻ bị TCC thỏa mãn đủ các tiêu chí đƣợc lấy mẫu trong vịng 48 giờ sau khi nhập viện và đƣợc bảo quản ở -200C. Hàng tháng, tại mỗi điểm giám sát các cán bộ tập hợp các mẫu và biên bản ghi chép đầy đủ thông tin yêu cầu và gửi về phòng kiểm nghiệm thuộc Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin và Sinh phẩm Y tế. Tất cả các mẫu này đều đƣợc chẩn đoán RV bằng kit ELISA. Lựa chọn các mẫu dƣơng tính có chỉ số OD cao tiến hành tách chiết ARN và xác định kiểu gen G và P của RV bằng phản ứng RT – PCR. Tổng hợp, phân tích số liệu dịch tễ học và đánh giá đặc tính các chủng RV tại Việt Nam.

Hình 6. Sơ đồ tóm tắt quy trình thực hiện

2.2.2. Phương pháp thực hiện

2.2.2.1. Lấy mẫu bệnh phẩm * Nguyên vật liệu:

Đối tượng nghiên cứu

Lấy mẫu nghiên cứu

Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA

Mẫu âm tính Mẫu dương tính

Chọn ngẫu nhiên

Tách ARN và chạy RT - PCR

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy  Tất cả các mẫu phân của trẻ từ 0 đến 5 tuổi nhập viện do TCC vào các bệnh

viện Nhi Trung Ƣơng, Nhi Khánh Hòa và Nhi Đồng I thành phố Hồ Chí Minh

 Các ống nhựa vơ trùng 15ml có nút đậy, nhãn, đá khơ (ice – box)…

 Thiết bị tủ lạnh âm sâu -200C để bảo quản mẫu.

* Các bước tiến hành:

Ngƣời nhà bệnh nhi đƣợc hƣớng dẫn lấy mẫu vào ống nhựa vơ trùng, dung tích 15ml có nút đậy, có nhãn ghi đầy đủ thơng tin tên, tuổi, ngày lấy mẫu, số bệnh phẩm.

Mẫu đƣợc bảo quản ở -200C sau đó đƣợc vận chuyển tới phòng kiểm nghiệm trong điều kiện đƣợc bảo quản lạnh.

Mỗi bệnh nhi đều có phiểu theo dõi ghi đây đủ các thơng tin: tên, tuổi, giới tính, địa chỉ, ngày vào viện, ngày lấy bệnh phẩm, các triệu chứng lâm sàng, số lần tiêu chảy trong ngày, kéo dài bao lâu, tính chất phân, độ mất nƣớc, sốt, nôn…

2.2.2.2. Xác định RV trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp ELISA

a. Nguyên lý của phương pháp

Hình 7. Sơ đồ mơ tả nguyên lý của phƣơng pháp ELISA

Kháng thể gắn trên các giếng sẽ kết hợp với kháng nguyên có trong mẫu bệnh phẩm. Kháng nguyên này sẽ kết hợp với cộng hợp kháng thể gắn enzym tạo thành phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym. Khi có cơ chất của

enzym thì cơ chất sẽ bị đổi màu. Nếu trong mẫu bệnh phẩm khơng có kháng ngun thì phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym không đƣợc tạo thành, cơ chất không bị đổi màu.

Luận văn thạc sÜ Phạm Thị Thu Thủy

b. Các bước tiến hành

* Chuẩn bị hóa chất và thiết bị

Bộ kit chẩn đoán virut Rota ProSpecT (Anh) gồm các thành phần:

Thành phần Thành phần chính

Phiến chuẩn độ 96 giếng Phủ kháng thể đa dịng thỏ đặc hiệu RV nhóm A Dung dịch pha lỗng Đệm muối tris

Đối chứng dƣơng RV bò bất hoạt

Cộng hợp Kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu RV gắn với horseradish peroxidase

Cơ chất TMB Cơ chất chứa chỉ thị màu: 3,3‟ – 5,5‟- tetramethylbenzidine

Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 0,46 mol/lit Đệm rửa 10X Dung dịch đệm phosphat

 Dụng cụ và nguyên vật liệu khác: chai đựng nƣớc, đệm, cồn, đồng hồ, giấy thấm…

 Thiết bị: máy đọc đĩa 96 giếng (Microwell plate reader), hãng themrmo Labsystems (Nhật) có thể đọc đƣợc bƣớc sóng 450nm

* Các bước tiến hành:

 Pha loãng mẫu 10% (100l mẫu + 900l dung dịch pha loãng)

 Nhỏ 2 giọt (100l) mẫu đối chứng dƣơng vào giếng đã đánh dấu đối chứng dƣơng

 Nhỏ 2 giọt (100l) mẫu đối chứng âm vào giếng đã đánh dấu đối chứng âm

 Nhỏ 2 giọt (100l) các mẫu đã pha loãng vào các giếng đã đánh dấu

 Nhỏ 2 giọt (100l) cộng hợp enzym vào tất cả các giếng, vỗ nhẹ trên thành giếng để hỗn hợp trên đƣợc trộn lẫn, đậy nắp và phủ giấy bạc

 Ủ ở nhiệt độ Phòng trong 60 ±5 phút

 Đổ dịch trong giếng, úp ngƣợc và đập nhẹ phiến lên giấy thấm loại bỏ hết dịch, rửa 5 lần bằng đệm rửa

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy  Nhỏ 2 giọt (100l) dung dịch dừng phản ứng vào từng giếng, lắc nhẹ phiến

 Quan sát bằng mắt thƣờng và đọc kết quả ở bƣớc sóng 450nm.

c. Đọc kết quả và kết luận

 Đọc kết quả bằng mắt thƣờng: so sánh màu của mẫu với màu của chứng dƣơng và chứng âm.

 Khi chưa nhỏ dung dịch dừng phản ứng:

Dương tính: có màu xanh Âm tính: khơng màu

Hình 8. Kết quả ELISA khi chƣa cho chất dừng phản ứng

 Sau khi đã nhỏ dung dịch dừng phản ứng:

Dương tính: có màu vàng Âm tính: khơng màu

Luận văn thạc sÜ Phạm Thị Thu Thủy  Đọc kết quả trên máy ELISA: tại bƣớc sóng 450nm, giá trị hấp phụ hiển thị trên

máy tính

 Tính kết quả ngƣỡng dƣơng tính:

X = 0,1 + giá trị OD của chứng âm

 Kết luận:

 Mẫu dƣơng tính: Khi có đơn vị hấp phụ lớn hơn hoặc bằng X

 Mẫu âm tính: Khi có đơn vị hấp phụ nhỏ hơn X

Hình 10. Đọc kết quả mẫu bệnh phẩm trên máy ELISA

2.2.2.3. Phương pháp tách chiết ARN từ mẫu phân

a. Nguyên tắc

Mẫu đƣợc ly giải trong điều kiện biến tính cao để bất hoạt RNase và bảo vệ ARN nguyên vẹn. Sau đó sử dụng đệm tạo điều kiện thích hợp để ARN liên kết với màng QIAamp và các mẫu đƣợc gắn vào cột QIAamp mini

ARN liên kết với màng và các tạp chất đƣợc loại đi bằng cách sử dụng 2 loại đệm rửa khác nhau. ARN tinh sạch sẽ đƣợc hịa tan trong đệm đặc biệt khơng chứa RNase.

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy

b. Nguyên vật liệu và thiết bị

 Kit tách chiết ARN: QIAamp Viral RNA mini Kit, hãng Qiagen, Mỹ Thành phần bộ kit gồm:

Tên hóa chất Thành phần chính Vai trị

Cột QIAamp mini

- Màng silicagel - Liên kết với ARN mẫu - Bền và không giữ lại Muối Đệm AVL - Guanidine

- Thiocyanate

- Ly giải, phá vỡ cấu trúc bậc 3 của protein, ADN/ARN và biến tính Đệm AW1 Đệm AW2 - Guanidine - hydrocloride - Loại bỏ tạp chất mà không ảnh hƣởng đến liên kết của ARN

Đệm AVE - Natri azid 0,04% - Hòa tan ARN bám trên màng - Tránh nhiễm khuẩn và RNase

- Tăng cƣờng liên kết acid nucleic của virut với màng QIAamp mini

Carier ARN - polyA - Bảo vệ ARN của virut khỏi RNase, tăng độ bền của ARN

 Dụng cụ và thiết bị khác:

o Pipet man và đầu côn tƣơng ứng, ống eppendorf, giá để ống

o Máy lắc vontex

o Máy ly tâm