2.2.2.3. Phương pháp tách chiết ARN từ mẫu phân
a. Nguyên tắc
Mẫu đƣợc ly giải trong điều kiện biến tính cao để bất hoạt RNase và bảo vệ ARN nguyên vẹn. Sau đó sử dụng đệm tạo điều kiện thích hợp để ARN liên kết với màng QIAamp và các mẫu đƣợc gắn vào cột QIAamp mini
ARN liên kết với màng và các tạp chất đƣợc loại đi bằng cách sử dụng 2 loại đệm rửa khác nhau. ARN tinh sạch sẽ đƣợc hòa tan trong đệm đặc biệt không chứa RNase.
Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy
b. Nguyên vật liệu và thiết bị
Kit tách chiết ARN: QIAamp Viral RNA mini Kit, hãng Qiagen, Mỹ Thành phần bộ kit gồm:
Tên hóa chất Thành phần chính Vai trị
Cột QIAamp mini
- Màng silicagel - Liên kết với ARN mẫu - Bền và không giữ lại Muối Đệm AVL - Guanidine
- Thiocyanate
- Ly giải, phá vỡ cấu trúc bậc 3 của protein, ADN/ARN và biến tính Đệm AW1 Đệm AW2 - Guanidine - hydrocloride - Loại bỏ tạp chất mà không ảnh hƣởng đến liên kết của ARN
Đệm AVE - Natri azid 0,04% - Hòa tan ARN bám trên màng - Tránh nhiễm khuẩn và RNase
- Tăng cƣờng liên kết acid nucleic của virut với màng QIAamp mini
Carier ARN - polyA - Bảo vệ ARN của virut khỏi RNase, tăng độ bền của ARN
Dụng cụ và thiết bị khác:
o Pipet man và đầu côn tƣơng ứng, ống eppendorf, giá để ống
o Máy lắc vontex
o Máy ly tâm
o Bể ổn nhiệt
o Dung dịch Vertrel
c. Quy trình tách chiết
Hút 100l mẫu phân vào 900l PBS tạo dung dịch 10%
Hút 200l dịch mẫu phân 10% vào týp và thêm 200l vertrel/mẫu
Vontex trong 1 phút, sau đó ly tâm 3000 vịng/phút trong 10 phút
Hút 140l dịch chiết trên vào 1 týp khác và thêm 560l/mẫu AVL (AVE–ARN carrier)
LuËn văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy Lắc, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút
Tra 630l lên cột QIAamp mini lần 1 vào ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút
Thêm tiếp 630l lên cột QIAamp mini lần 2 và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Thay ống thu mẫu bằng ống mới
Cho 500l dung dịch rửa AW1 (có Ethanol) vào cột và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Thay ống thu mẫu bằng ống mới
Cho 500l dung dịch rửa AW2 (có Ethanol) vào cột và ly tâm 14000 vịng/phút trong 3 phút. Thay ống thu mẫu bằng eppendorf 1,7ml mới
Thêm 50l AVE và ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút
Ly tâm 8000 vòng/phút để thu đƣợc ARN mẫu.
2.2.2.4. Phương pháp xác định týp RV bằng RT – PCR
a. Nguyên lý của phương pháp
Phƣơng pháp nested RT – PCR đƣợc sử dụng để xác định kiểu gen RV lƣu hành, Phản ứng RT – PCR gồm 2 bƣớc:
Trong lần PCR thứ nhất (PCR1), ARN kép của RV tách chiết từ mẫu phân đƣợc dùng làm khuôn cho quá trình phiên mã ngƣợc, đồng thời xảy ra phản ứng khuếch đại nhờ sử dụng enzym Taq polymerase. Sản phẩm của PCR1 đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp các đoạn ADN đặc trƣng cho từng kiểu gen G và P.
Phản ứng PCR2 sử dụng hỗn hợp các mồi (primer) đặc hiệu cho các týp, các mồi nằm ở các vùng biến đổi của gen nhƣng mỗi týp huyết thanh vùng này lại không thay đổi. Sản phẩm của PCR2 thu đƣợc sẽ tiến hành chạy điện di giúp xác định kiểu gen của RV.
Lun vn thc s Phạm Thị Thu Thy
Bng 5. Các primer đƣợc sử dụng để định týp G và týp P
Giai
đoạn Tên primer Trình tự (5’ – 3’)
Vị trí trên đoạn gen Primer đặc hiệu c ho k iểu gen G PCR1
VP7 - E ATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC 51-71 VP7 – R AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC 914-932
PCR2
VP7 - R AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC 914-932 aBT1 (G1) CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G 314-335 aCT2 (G2) CAA TGA TAT TAA CAC ATT TTC TGT
G 411-435
mG3 (G3) ACG AAC TCA ACA CGA GAG G 250-269 aDT4 (G4) CGT TTC TGG TGA GGA GTT G 480-498 aDT8 (G8) GTC ACA CCA TTT GTA AAT TCG 178-198 mG9 (G9) CTT GAT GTG ACT AYA AAT AC 757-776 mG10 (G10) ATG TCA GAC TAC ARA TAC TGG 666-687
Primer đặc
hiệu c
ho k
iểu gen P
PCR1
VP4 – F TAT GCT CCA GTN AAT TGG 132-149 VP4 - R ATT GCA TTT CTT TCC ATA ATG 775-795
PCR2
VP4 - F TAT GCT CCA GTN AAT TGG 132-149 2T–1 (P[4]) CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC 474-494 3T–1(P[6]) TGT TGA TTA GTT GGA TTC AA 259-278 1T–1D (P[8]) TCT ACT GGT TTR CAN TGC 339-356 4T–1 (P[9]) TGA GAC ATG CAA TTG GAC 385-402 5T–1 (P[10]) ATC ATA GTT AGT AGT CGG 575-594 Mp[11] GTA AAC ATC CAG AAT GTG 305-323
Luận văn thc s Phạm Thị Thu Thy
V trớ ca các primer trong phản ứng PCR và sự hình các đoạn gen khác nhau của gen G và P đƣợc thể hiện ở hình sau: