Bản phiên mã đầu tiên Gen P[6] Gen P[11] Gen P[8] Gen P[9] Gen P[4] Gen P[10]
Luận văn thạc s Phạm Thị Thu Thy
b. Nguyờn vt liệu và thiết bị
* Thiết bị:
Máy PCR Model: Gene Amp PCR System 9700, Applied Biosystems, Mỹ
Máy trộn IKA, Anh
Máy ly tâm Hettich, Đức
Máy làm đá Fiocchetti, Mỹ
* Nguyên vật liệu chung:
PCR đệm 10X
25mM MgCl2
RT
Taq ADN polymerase
100mM dNTPs Nusieve GTG agarose Seaplaque agarose TBE 10X Loading dye 6X GeneRuller 100 bp ADN
Khay đựng, pipet aid, đầu côn, eppendorf…
c. Các bước tiến hành
* Các bước tiến hành chạy RT – PCR định týp G
Chuẩn bị Master Mix cho PCR1:
Thành phần Thể tích (l)/mẫu RNA 5 Đệm 10X (chứa Mg2+) 10 dNTPs (5 mM) 4 DMSO 7 VP7E (100 ng) 1 VP7R (100 ng) 1 H2O (DEPC, deionized) 70,7 Tổng 98,7
Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy Thực hiện PCR1:
o Tính số mẫu cần xác định týp G, lấy đủ ống và ghi tên mẫu hay kí hiệu
o Lấy 5l ARN đã tách chiết của từng mẫu cho vào mỗi ống
o Bổ sung Master Mix vào các ống phản ứng với tổng thể tích là 98,7l
o Đặt các ống vào máy PCR và biến tính ở 970
C/5 phút
o Lấy mẫu ra nhanh và đặt trong đá 3 phút
o Cho tiếp 1 l RT/ mẫu và 0,3 l Taq/ mẫu
o Đặt mẫu vào máy PCR và cài đặt chạy chƣơng trình nhiệt để tổng hợp cDNA ở 420C/60 phút, tiếp tục chạy PCR1 với chƣơng trình 940C/1 phút, 420C/2 phút; 680C/1 phút trong 30 chu kỳ
o Kết thúc chƣơng trình lấy mẫu ra vào bảo quản ở 40
C.
Chuẩn bị Master Mix cho PCR2:
Thành phần Thành phần (l)/mẫu cDNA 1 Đệm 10X (Chứa Mg2+) 10 dNTPs (5 mM) 4 DMSO 7 VP7E (100 ng) 1 Gmix (100 ng) 4 H2O (DEPC, deionized) 72.7 Taq 0.3 Tổng số 100 Thực hiện PCR2:
o Lấy đủ số ống và ghi rõ kí hiệu
o Bổ sung 99l Master Mix vào mỗi ống và thêm 1l sản phẩm PCR1
o Chạy PCR theo chƣơng trình: 940
C/1 phút; 420C /2 phút; 680C /1 phút trong 30 chu kỳ
Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy
* Các bước tiến hành chạy RT – PCR định týp P
Chuẩn bị Master Mix cho PCR1:
Thành phần Thể tích(l)/mẫu RNA 5 Đệm 10X (Chứa Mg2+) 10 dNTPs (5 mM) 4 DMSO 7 VP4F (100 ng) 1 VP4R (100 ng) 1 H2O (DEPC, deionized) 70.7 Tổng 98.7
Chuẩn bị Master Mix cho PCR2:
Thành phần Thể tích(l)/mẫu cDNA 5 Đệm 10X (Chứa Mg2+ ) 10 dNTPs (5 mM) 4 VP4F (100 ng) 1 Pmix (100 ng) 6 H2O (DEPC, deionized) 73.7 Taq 0.3 Tổng 100
Thực hiện các bƣớc tƣơng tự xác định kiểu gen G với chƣơng trình chạy PCR cài đặt nhƣ sau:
o Chƣơng trình nhiệt để tổng hợp cDNA ở 420C/60 phút, tiếp tục chạy PCR1 với chƣơng trình: 940
C/1 phút; 500C /2 phút; 720C/1 phút trong 30 chu kỳ.
o Chƣơng trình PCR2: 940C/1 phút; 500C/2 phút; 720C/1 phút trong 40 chu kỳ.
2.2.2.5. Chạy điện di và đọc kết quả
a. Nguyên lý
Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy
b. Nguyên vật liệu và thiết bị
Thạch Agarose 2%
Dung dịch ethidium bromide (0,5mg/ml)
Dung dịch đệm chạy điện di TBE 1X
Thang chuẩn 100 Bp Ruller
Thuốc nhuộm Gel loading Dye 6X
Giấy parafin
Bộ điện di gồm: khay đổ thạch và lƣợc, bể điện di, nguồn cung cấp dòng điện 1 chiều
Máy chụp ảnh gel có đèn tím nối với máy vi tính.
c. Các bước tiến hành
Pha thạch Agarose 2% trong đệm TBE 1X
Đổ thạch, mỗi bản gel cần khoảng 70 – 80 ml, đặt bản gel vào bể điện di sao cho ngập bản gel.
Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu lên bản gel
Hút 5 ml sản phẩm PCR2 trộn đều với 3 ml loading Dye 6X trên giấy parafin và nạp toàn bộ hỗn dịch này lên các giếng trên bản gel. Sắp xếp các mẫu theo sơ đồ và ghi lại (trong đó 01 giếng chính giữa nạp thang chuẩn)
Tiến hành chạy điện di ở hiệu điện thế 150V, 60 mA khi mẫu chạy đƣợc 3/4 chiều dài bản gel là đƣợc
Nhuộm bản gel sau điện di trong Dung dịch ethidium bromide 0,5mg/ml trong 30 – 45 phút
Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Thu Thủy