Hóa chất và thiết bị

CHƢƠNG 2 : THỰC NGHIỆM

2.3. Hóa chất và thiết bị

2.3.1. Hóa chất

Các hóa chất dùng trong phƣơng pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích

2.3.1.1. Chất chuẩn

Amlodipin besilat (SKS: 0415019, hàm lƣợng 100,04% (nguyên trạng), Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng),

Perindopril tert-butylamin (SKS: 0107210, hàm lƣợng 100,0% (nguyên trạng), Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng).

2.3.1.2. Hóa chất dung mơi

Hóa chất loại tinh khiết phân tích: L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lƣợng > 99,5%); L- Histidine (C6H9N3O2) (Fluka, hàm lƣợng 99,5%); Tris, axit axetic

Lấy 5ml nƣớc tiểu vào ống nghiệm

Kiềm hóa mẫu về pH 9 bằng dung dịch NH3 ( kiểm tra bằng giấy quỳ)

Chiết mẫu bằng 3ml n-butyl aceat lắc trong 20 phút

Ly tâm cho tách lớp

Hút lớp n-butyl acetat ( lớp trên) đuổi dung mơi bằng khí N2, đƣợc cặn chiết

(CH3COOH), axit clohydric (HCl), axit ascobic (C6H8O6), natri hydroxyd (NaOH), methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức)

Nƣớc đêion: Bộ lọc nƣớc của hãng Scientech (Mỹ)

2.3.1.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

Pha dung dịch chuẩn gốc

Amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin đƣợc pha trong dung mơi là methanol:

Cân chính xác 25,00 mg (amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin) mỗi loại chuyển vào bình định mức 25,00 ml. Thêm 5,00 ml methanol và đem rung siêu âm trong 30 phút, sau đó định mức tới vạch bằng nƣớc đề-ion thu đƣợc dung dịch gốc có nồng độ 1000,00 ppm. Dung dịch đƣợc bảo quản trong tủ lạnh từ 2- 8ºC, tránh ánh sáng và có thể sử dụng trong vòng 3 tháng.

Từ dung dịch chuẩn trên ta có thể pha các dung dịch chuẩn làm việc có các nồng độ khác nhau nhƣ dung dịch chuẩn: 200,00; 150,00; 100,00; 60,00; 50,00; 40,00; 20,00; 10,00; 5,10 ppm…Các dung dịch làm việc đƣợc pha hàng ngày.

Pha dung dịch đệm

Các dung dịch đệm điện di đƣợc cân và pha trực tiếp vào bình định mức bằng nƣớc đề-ion. Tất cả các dung dịch đều đƣợc rung siêu âm và chuẩn lại giá trị pH trƣớc khi sử dụng. Dung dịch đệm đƣợc pha mới hàng ngày.

2.3.2. Thiết bị dụng cụ

Thiết bị:

 Thiết bị CE-C4D đƣợc thiết kế và chế tạo bởi công ty 3S Analysis (http://www.3sanalysis.vn/) phối hợp với nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (khoa Hóa Học, trƣờng đại học Basel, Thụy Sỹ). Đây là thiết bị điện di mao quản dạng xách

tay, lần đầu tiên trên thế giới sử dụng nguồn thế cao mini của hãng Spellman với điện thế cực đại lên đến 20kV – (Các thiết bị này sẽ đƣợc cơng bố trên các tạp chí quốc tế trong thời gian sắp tới). Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối theo kiểu tụ điện (C4D) đƣợc thiết kế ở dạng thu nhỏ, với nguồn kích thích 200V, với hai điện cực hình ống đồng trục có chiều dài 4mm, và đƣờng kính 400 µm đặt cách nhau 1mm. Tấm chắn Faraday (nối đất) đƣợc sử dụng để ngăn cách hai điện cực.

Hình 2.1: Ảnh chụp thiết bị CEC4D triển khai tại Việt Nam 1: Hộp thế 1: Hộp thế

2: Điều khiển cao thế 3: Detector

4: Ống dẫn dung dịch đệm 5: Nút điều chỉnh

6: Bộ phận điều khiển 7: Hộp khí

 Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521  Bộ lọc nƣớc đêion của hãng Scientech (Mỹ)

 Máy đo pH của hãng HANNA với điện cực thủy tinh và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH

 Cân phân tích của hãng Scientech (Mỹ), độ chính xác 0,0001 g  Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu

 Máy ly tâm LCEN-200

Dụng cụ

 Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, cốc thủy tinh

 Pipet pasteur với các cỡ khác nhau: 20; 200 và 1000 µl và đầu tip tƣơng ứng  Các bình định mức nhựa polypropylen (PP) 25 và 100 ml đƣợc sử dụng để pha

các dung dịch gốc của các chất phân tích và các dung dịch đệm

 Các lọ Falcon 15 ml và lọ polypropylen (PP) để đựng các dung dịch chuẩn  Đầu lọc có đƣờng kính lỗ lọc 0,45 µm

 Các xy lanh lọc để lọc mẫu

 Mao quản đƣờng kính trong 50 µm, chiều dài 55 cm  Các dụng cụ thơng thƣờng khác của phịng thí nghiệm

2.4. Các thơng số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích

2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp phân tích. phân tích.

- Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.

Đối với các q trình sắc ký, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3 [4].

- Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với

tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền. Thơng thƣờng, với các quá trình sắc ký giá trị LOQ đƣợc xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10 [4].

2.4.2. Độ chụm (độ lặp lại) của phƣơng pháp

Độ lặp lại đặc trƣng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi tiến hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, đƣợc tiến hành bằng một phƣơng pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (cùng ngƣời phân tích, cùng trang thiết bị, phịng thí nghiệm, trong các khoảng thời gian ngắn) [6].

Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%)

Cơng thức tính độ lêch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) nhƣ sau [19]:   1 2     n S S SD i tb (2.3)  % x100 S SD RSD tb  (2.4) Trong đó:

- Si là diện tích của pic điện di thứ i - Stb là diện tích trung bình của n lần chạy - n là số lần chạy lặp (n =6)

2.4.3. Độ đúng (độ thu hồi) của phƣơng pháp

Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu đƣợc chấp nhận. Do đó, thƣớc đo độ đúng thƣờng đánh giá qua sai số tƣơng đối hay bằng cách xác định độ thu hồi [5, 6].

Độ thu hồi (H):  100 lt tt C C H (2.5) Trong đó:

Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích thu đƣợc (tính theo đƣờng chuẩn) Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính tốn từ lƣợng chuẩn thêm vào Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu từ trƣớc khi xử lý mẫu ta có độ đúng của phƣơng pháp, cịn nếu chất chuẩn đƣợc thêm vào trƣớc khi bơm vào thiết bị ta có độ thu hồi của thiết bị.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện xác định amlodipin bessilat và perindopril tert-butylamin bằng phƣơng pháp điện di mao quản CE-C4D perindopril tert-butylamin bằng phƣơng pháp điện di mao quản CE-C4D

Việc khảo sát một số điều kiện xác định amlodipin besilat và perindopril tert butylamin đƣợc thực hiện trên thiết bị điện di CE- C4D với nồng độ hỗn hợp chất chuẩn tƣơng ứng là 40,00 ppm và 20,00 ppm

Thí nghiệm đƣợc tiến hành với cột mao quản với tổng chiều dài Ltot = 55 cm, chiều dài hiệu dụng Leff = 40 cm, đƣờng kính trong 50 µm. Mẫu đƣợc bơm vào mao quản bằng phƣơng pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông bằng cách nâng một đầu mao quản trong dung dịch mẫu lên độ cao 20 cm so với đầu mao quản còn lại và độ cao này đƣợc giữ nguyên trong tất cả các thí nghiệm. Điện thế tách sử dụng là -15 kV.

3.1.1. Khảo sát ảnh hƣởng của hệ đệm

Trong phƣơng pháp CE-C4D, dung dịch đệm điện di có vai trị rất quan trọng trong việc xác định tính chất và đặc trƣng của các quá trình xảy ra trong mao quản, giúp duy trì, ổn định dịng điện trong mao quản và ản h hƣởng đến tốc độ điện di của chất phân tích. Trong dung dịch đệm điện di, ba yếu tố gồm: pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm điện di ảnh hƣởng nhiều nhất tới khả năng tách các chất trong q trình phân tích. Do đó, việc khảo sát và xác định điều kiện tối ƣu là một công việc rất cần thiết. Ngồi các điều kiện đó ra cịn cần phải khảo sát các yếu tố khác ảnh hƣởng đến khả năng phân tách và cƣờng độ tín hiệu nhƣ thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu.

3.1.1.1. Khảo sát pH của dung dịch đệm điện di

Trong phƣơng pháp điện di mao quản, giá trị pH thay đổi sẽ làm thay đổi điện tích, tốc độ của các chất cũng nhƣ tốc độ di chuyển của dịng EOF cũng thay đổi , từ đó làm thay đổi thời gian di chuyển của các chất phân tích trong mao quản. Với mao quản silica, vùng giá trị pH điện di thƣờng dùng và có thể thay đổi trong khoảng từ 2 – 10 tùy thuộc vào mỗi loại chất phân tích . Ngồi ra, cịn cần quan tâm đến giá trị pK của

các chất phân tích vì nó ảnh hƣởng trực tiếp đến mức độ phân ly của các nhóm chức trong phân tử chất đó ở các giá trị pH khác nhau. Vì thế đối với mỗi loại chất phân tích trong q trình điện di có một giá trị pH nhất định của pha động là thích hợp và cho kết quả tốt nhất. Chất phân tích Am có giá trị pKa = 8,60; Per có giá trị pKa = 3,00; 5,70 nên việc khảo sát đƣợc thực hiện trong khoảng pH từ 4 đến 9.

Các điều kiện dùng để thực hiện khảo sát nhƣ mục 3.1, thời gian bơm mẫu là 30s với các giá trị pH khảo sát là 4, 5, 6, 7, 8, 9. Giá trị pH đƣợc điều chỉnh bằng máy đo pH trên cơ sở giữ nguyên nồng độ hợp phần bazơ (Tristidin - Tris) là 10mM và thêm dần hợp phần axit (axit Axetic - Ace) vào cho đến khi đạt giá trị pH mong muốn.

Các kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đến diện tích pic Spic và thời gian di chuyển (t) của hỗn hợp amlodipin besilat, perindorpil tert-butylamin đƣợc nêu trong bảng 3.1. Để thể hiện rõ hơn các pic Am và Per, tách điện di đồ phân tích đồng thời 2 chất thành 2 điện di đồ phân tích từng chất nhƣ Hình 3.1a và Hình 3.1b

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của Am, Per

pH Am ( nồng độ 40ppm) Per (nồng độ 20ppm) Spic (mV.s) t (s) Spic (mV.s) t (s) 9 - - 51,77 152 8 22,40 123 50,99 192 7 24,28 131 58,60 221 6 26,68 140 32,56 233 5 33,81 145 26,64 238 4 46,43 196 - -

200 150

100 50

Thoi gian di chuyen (s) Am pH=9 Am Am Am Am pH=8 pH=7 pH=6 pH=5 pH=4 20mV

Hình 3.1a. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến sự phân tách của Am

300 250 200 150 100 t (s) Per pH=9 Per Per Per Per pH=8 pH=7 pH=6 pH=5 pH=4 20mV

Hình 3.1b. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến sự phân tách của Per

Khi quá trình điện di thực hiện ở pH lớn hơn pKa sẽ làm cho chất phân tích mang điện tích âm và ngƣợc lại nếu q trình điện di thực hiện ở pH thấp hơn giá trị pKa sẽ làm cho chúng mang điện tích dƣơng. Do đó trong khoảng khảo sát pH từ 4 đến 8 khi phân cực theo chiều dƣơng thì Am sẽ mang điện tích dƣơng và di chuyển ra trƣớc

dịng EOF, cịn Per mang điện tích âm nên ra sau dịng EOF vì bị dịng EOF kéo đi. Cả 2 pic của Am và Per đều quay xuống so với đƣờng nền do độ dẫn của chất phân tích nhỏ hơn độ dẫn nền.

Từ kết quả khảo sát trong khoảng pH từ 4 - 9 cho thấy, khi pH tăng thì tổng thời gian phân tích giảm, nhƣng đồng thời diện tích pic của Am giảm và Per lại tăng. Điều này đƣợc giải thích là khi pH của dung dịch đệm càng tăng thì thành mao quản càng âm điện, dòng EOF tăng dẫn đến tốc độ di chuyển của chất tăng và làm cho thời gian phân tích giảm, ngồi ra khi pH giảm thì ngƣợc lại. Trong khi đó khi pH tăng thì độ dƣơng điện của các chất giảm do đó diện tích của Am giảm và Per tăng. Tuy nhiên khi so sánh kết quả khảo sát thu đƣợc với các giá trị pH trên thì thấy rằng tại pH = 9,0 không cho pic Am, tại pH = 4 không cho pic Per. Với giá trị pH = 8 cho kết quả pic tƣơng đối tốt, tín hiệu đƣờng nền ổn định , thời gian phân tích hợp lý , diện tích pic lớn. Do mục tiêu luận văn là nghiên cứu phân tích hàm lƣợng tổng mà khơng quan tâm đến từng dạng đồng phân, vì thế tại pH = 8 đƣợc coi là tối ƣu và đƣợc chọn dùng cho các khảo sát tiếp theo.

3.1.1.2. Khảo sát thành phần của hệ đệm điện di

Trong phƣơng pháp điện di, thành phần dung dịch đệm cũng ảnh hƣởng rất nhiều đến kết quả phân tích điện di. Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần dung dịch đệm đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng hợp phần bazơ là Tris, Arg và hợp phần axit là ascorbic (Asc) hoặc acetic (Ace). Trong đó, hợp phần bazơ đƣợc giữ nguyên nồng độ 10 mM và dùng hợp phần axit để điều chỉnh đến pH = 8

Thực hiện q trình khảo sát phân tích điện di với các điều kiện nhƣ mục 3.1. Thế điện di -15 kV, chiều cao bơm mẫu 20 cm, thời gian bơm mẫu 30 s. Điều kiện bơm mẫu:

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc diện tích pic của Am và Per vào thành phần hệ đệm điện di Thành phần hệ đệm điện di Am ( nồng độ 40,00 ppm) Per (nồng độ 20,00 ppm) Spic (mV.s) tdc (s) Spic (mV.s) tdc (s) Tris/asc 16,73 114 32,99 164 Tris/ace 23,04 123 50,99 192 Arg/ace 20,69 131 61,15 221 200 150 100 50 t (s) Am Am Am Tris/ace Arg/ace Tris/asc 20mV

200 150 100 50 t (s) Per Per Per Tris/ace Arg/ace Tris/asc 20mV

Hình 3.2. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần hệ đệm đến sự phân tách của Am, Per.

Từ các kết quả khảo thu đƣợc cho thấy, hệ đệm Tris/ace cho đƣờng ổn định hơn 2 hệ đệm Tris/asc và Arg/ace. Trong đó hệ đệm Tris/ace cho diện tích pic của chất phân tích lớn hơn hệ đệm Tris/asc và thời gian điện di nhanh hơn hệ đệm Arg/ace. Do đó hệ đệm Tris/ace đƣợc lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.

3.1.1.3. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm điện di

Sau khi tối ƣu đƣợc pH và thành phần hệ đệm, nồng độ hệ đệm điện di cũng cần phải khảo sát. Trong phƣơng pháp điện di mao quản, nồng độ đệm phải đủ lớn để tạo nên môi trƣờng điện ly cho các ion di chuyển và không tạo ra các vùng dẫn điện khác nhau trong mao quản làm ảnh hƣởng đến quá trình di chuyển. Trong nghiên cứu này việc khảo sát nồng độ đệm đƣợc tiến hành với hệ đệm Tris/ace tại 3 mức nồng độ: 7 mM, 10 mM, 15 mM. Các điều kiện khác bao gồm:

- Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của Am 40,00 ppm và Per 20,00 ppm

- Thế điện di -15 kV, thời gian bơm mẫu 30 s, chiều cao bơm mẫu 20 cm - Hệ đệm Tris/ace với pH = 8

Các kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch đệm điện di đƣợc thể hiện trong Bảng 3.3 và Hình 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của Am và Per vào nồng độ dung dịch đệm điện di

Nồng độ hệ đệm điện di (mM) Am ( nồng độ 40,00 ppm) Per (nồng độ 20,00 ppm) Spic (mV.s) tdc (s) Spic (mV.s) tdc (s) 7 25,80 113 67,77 182 10 23,04 123 50,99 192 15 17,50 128 61,15 206 200 150 100 50 t (s) Am Am Am Per Per Per 7mM 10mM 15mM 20mV

Hình 3.3. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di đến quá trình phân tách các chất Am và Per.

Từ kết quả khảo sát nồng độ đệm qua Hình 3.3 và Bảng 3.3 cho thấy: càng tăng nồng độ dung dịch đệm điện di thì thời gian di chuyển của cả 2 chất phân tích Am và Per đều tăng nhƣng diện tích pic lại giảm. Điều này có nghĩa là trong ống mao quản ,

khi nồng độ đệm tăng, tức là nồng độ của các ion tăng , thƣờng làm thay đổi độ lớn của lớp điện kép, ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác tĩnh điện Culong của chất tan với thành mao quản. Lớp điện kép này thƣờng làm cho thời gian di chuyển của chất tan tăng .Khi nồng độ đệm tăng cũng làm tăng độ dẫn điện của dung dịch điện ly nền, làm giảm tín hiệu