(1, 2, 3, 4 lần lượt là thời gian lắc trong 10, 15, 20 và 25 phút)
Từ kết quả trên cho thấy càng tăng thời gian lắc hiệu suất thu hồi càng lớn. Tại thời gian lắc là 10 và 15 phút, chất phân tích chƣa đủ thời gian để hịa tan tối đa vào dung mơi chiết nên hiệu suất chiết không cao. Với thời gian lắc 20 và 25 phút, hiệu suất chiết đạt bão hòa, nhƣng tại 20 phút điện di đồ cho đƣờng nền và tín hiệu pic đẹp nhất nên đây sẽ là giá trị đƣợc chúng tơi lựa chọn cho qui trình chiết.
Nhƣ vậy quy trình chiết lỏng – lỏng để phân tích Am trong mẫu nƣớc tiểu đã đƣợc nghiên cứu với điều kiện tối ƣu nhƣ sau: 3ml dung môi chiết n-butyl acetat, pH chiết = 9, thời gian lắc 20 phút.
3.4.5. Đánh giá phƣơng pháp phân tích Amlodipin besilat trong mẫu nƣớc tiểu bằng phƣơng pháp CE – C4D kết hợp xử lý mẫu phân tích bằng chiết lỏng – lỏng
Giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp (MQL) đƣợc xác định bằng cách thêm chuẩn Am với các nồng độ 140,00 ppb; 150,00 ppb; 160,00 ppb vào ba mẫu trắng rồi tiến hành chiết pha lỏng và phân tích trên thiết bị CE – C4D. Kết quả cho thấy ở nồng độ 150,00 ppb trong nền mẫu nƣớc tiểu bắt đầu xuất hiện pic
có thể quan sát đƣợc và cho giá trị S/N= 3,26. Nhƣ vậy MDL của phƣơng pháp là 150,00 ppb và MQL tƣơng ứng là 500,00 ppb.
Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc đánh giá bằng cách tiến hành chiết 3 mẫu giống nhau ở các mức thêm chuẩn là 600,00 ppb vào 5 ml mẫu trắng, kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 3.19
Bảng 3.19. Độ lặp lại của phương pháp CE – C4D kết hợp với chiết lỏng-lỏng để xác định Am trong mẫu nước tiểu.
1 2 3
Nồng độ Am thêm chuẩn (ppb) 600,00 600,00 600,00 Nồng độ Am thu hồi 521,01 525,04 512,12 Hiệu suất thu hồi (%) 86,83 87,50 85,33
RSD (%) n=3 2.95
Từ kết quả Bảng 3.19 thấy hiệu suất thu hồi của Am qua các lần chiết tƣơng tự
nhau với giá trị RSD % nhỏ hơn 5% cho thấy độ lặp của phƣơng pháp tƣơng đối tốt đáp ứng yêu cầu của AOAC
Độ đúng của phƣơng pháp đƣợc đánh giá qua hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp phân tích. Q trình đánh giá đƣợc thực hiện ở 3 mức thêm chuẩn khác nhau trên nền mẫu trắng.
+ Mức 1: Thêm 30 µl dung dịch chuẩn 100,00 ppm vào 5ml mẫu trắng + Mức 2: Thêm 35 µl dung dịch chuẩn 100,00 ppm vào 5ml mẫu trắng + Mức 3: Thêm 40µl dung dịch chuẩn 100,00 ppm vào 5ml mẫu trắng
Các mẫu đƣợc xử lý theo quy trình tối ƣu ở trên. Kết quả đƣợc trình bày trong
Bảng 3.20. Độ thu hồi của phương pháp CE – C4D xác định Am kết hợp xử lý mẫu nước tiểu bằng chiết lỏng – lỏng
Mức 1 Mức 2 Mức 3
Nồng độ Am thêm chuẩn vào (ppb) 600,00 700,00 800,00 Nồng độ Am thu hồi đƣợc (ppb) 521,03 601,12 710,16 Hiệu suất thu hồi (%) 86,83 85,85 88,75
Độ thu hồi trung bình (%) 87,14
Nhƣ vậy, chiết lỏng- lỏng kết hợp với phƣơng pháp CE – C4D để xử lý mẫu nƣớc tiểu cho kết quả độ lặp lại, hiệu suất thu hồi tốt và giới hạn phát hiện cỡ 150,00 ppb.
3.4.6. Phân tích mẫu nƣớc tiểu thực tế
Mẫu nƣớc tiểu đƣợc lấy từ 3 bệnh nhân khác nhau (M1, M2, M3) với thời gian lấy mẫu là sau 10h, 12h và 14h uống thuốc. Các mẫu đƣợc xử lý theo quy trình tối ƣu 2.3.2 và đƣợc bơm vào thiết bị điện di.
Điện di đồ mẫu nƣớc tiểu của bệnh nhân M1 sau 10h, 12h và 14h uống thuốc đƣợc thể hiện trên hình 3.20, 3.21 và 3.22 180 160 140 120 100 80 60 40 t (s) (1) (2) 10 mV Am
Hình 3.20. Điện di đồ phân tích mẫu nước tiểu thực tế M1sau 10h uống thuốc (1 và 2 tương ứng là đường mẫu ban đầu và đường thêm chuẩn)
180 160 140 120 100 80 60 t (s) Am 5mV (1) (2)
Hình 3.21. Điện di đồ phân tích mẫu nước tiểu thực tế M1 sau 12h uống thuốc (1 và 2 tương ứng là đường mẫu ban đầu và đường thêm chuẩn)
160 140 120 100 80 60 t (s) (1) (2) 5 mV Am
Hình 3.22. Điện di đồ phân tích mẫu nước tiểu thực tế M1 sau 14h uống thuốc (1 và 2 tương ứng là đường mẫu ban đầu và đường thêm chuẩn)
Từ điện di đồ mẫu nƣớc tiểu M1 cho thấy sự xuất hiện pic của Am và sự thải trừ Am qua nƣớc tiểu sau 3 lần lấy mẫu ở 3 thời điểm khác nhau sau khi uống thuốc. Có thể thấy hàm lƣợng Am trong 3 mẫu thay đổi rõ rệt, hàm lƣợng Am thải trừ sau 10h là
lớn nhất, sau 12h và 14h hàm lƣợng Am giảm mạnh đồng thời xuất hiện thêm 1pic sát bên cạnh pic của Am, có thể là một sản phẩm phụ từ q trình phân hủy của amlopidin trong quá trình đào thải. Sự xuất hiện của pic này kèm với diện tích pic rất nhỏ của Am trong các mẫu lấy sau 12 và 14 h kể từ khi uống khơng cho phép định lƣợng chính xác hàm lƣợng của Am trong mẫu.
Trong Bảng 3.22 là kết quả xác định hàm lƣợng Am thải trừ qua mẫu nƣớc tiểu của 3 bệnh nhân M1, M2 và M3 sau thời gian sử dụng thuốc là 10h.
Bảng 3.21. Hàm lượng Am trong mẫu nước tiểu M1, M2 và M3
Spic (mV.s) Nồng độ xác định (ppm)
Mẫu M1 20,21 35,02
Mẫu M2 19,18 28,04
Mẫu M3 17,88 25,11
Kết quả cho thấy hàm lƣợng Am trong 3 mẫu nƣớc tiểu của 3 bệnh nhân dao động trong khoảng từ 25,11 đến 35,02 ppm. Nhƣ vậy có thể khẳng định rằng sử dụng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng kết hợp với CE – C4D có thể phát hiện và định lƣợng đƣợc sự có mặt của Am trong các mẫu nƣớc tiểu.
KẾT LUẬN
Sau quá trình nghiên cứu và thực hiện, với mục đích ứng dụng phƣơng pháp điện di mao quản tích hợp detector đo độ dẫn khơng tiếp xúc (CE-C4D) để tách và xác định amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin trong mẫu dƣợc phẩm, Amlodipin besilat trong mẫu nƣớc tiểu, luận văn đã thu đƣợc các kết quả sau:
1. Đã tối ƣu đƣợc các điều kiện tách và xác định amlodipin besilat và perindopril tert butylamin bằng phƣơng pháp CE - C4D. Các điều kiện tối ƣu bao gồm: dung dịch diện ly: đệm Tris/ace (10 mM) tại pH = 8; mao quản silica, tổng chiều dài 55 cm, chiều dài hiệu dụng 40cm, đƣờng kính trong 50 µm với thời gian bơm mẫu là 30s, ở chiều cao h = 25cm.
2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích:
- Xây dựng đƣờng chuẩn xác định các chất phân tích amlodipin besilat trong khoảng nồng độ từ 17,00- 80,00 ppm và perindopril tert-butylamin trong khoảng nồng độ 5,00-150,00 ppm. Đƣờng chuẩn có độ tuyến tính cao: các giá trị R2 đều lớn hơn 0,9995, độ lặp lại tốt (RSD < 3% )
- Xác định độ đúng: Hiệu suất thu hồi của cả Am và Per nằm trong khoảng 93 – 100% so với lƣợng chuẩn thêm vào nền mẫu trắng, điều này cho thấy phƣơng pháp có độ đúng cao.
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) của Am và Per tƣơng ứng là 5,00 ppm và 1,00 ppm, giới hạn định lƣợng (LOQ) của Am và Per lần lƣợt là 17,00 ppm và 5,00 ppm.
3. Ứng dụng phƣơng pháp đã nghiên cứu để phân tích một số mẫu dƣợc phẩm có chứa riêng từng chất phân tích Am ( có trong thuốc Ambelin và Amlodipin) và Per (có trong thuốc Coversyl) cũng nhƣ xác định đồng thởi cả Am và Per ( có trong thuốc Coveram)
4. Khảo sát xây dựng quy trình phân tích amlodipin besilat trong mẫu nƣớc tiểu với các điều kiện tối ƣu nhƣ sau: 3ml dung môi n-butyl acetat, pH chiết = 9, thời gian lắc 20 phút. Ứng dụng quy trình để phân tích 3 mẫu thực tế, kết quả ban đầu cho thấy đã phát hiện và định lƣợng đƣợc amlodipin besilat trong mẫu nƣớc tiểu của bệnh nhân sử dụng thuốc có chứa hoạt chất.
Từ các kết quả thu đƣợc cho thấy phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE – C4D) phù hợp với việc xác định đồng thời amlodipin besilat và perindopril tert-butyl amin trong mẫu dƣợc phẩm và việc kết hợp CE - C4D với kỹ thuật chiết lỏng – lỏng đã xác định thành công amlodipin besilat trong mẫu nƣớc tiểu. Nhƣ vậy phƣơng pháp có thể trở thành 1 phƣơng pháp hữu hiệu để thanh tra và kiểm định nhanh (thậm chí có thể triển khai thực hiện tại hiện trƣờng) chất lƣợng sản phẩm phục vụ trong lĩnh vực dƣợc phẩm bảo vệ sức khỏe ngƣời tiêu dùng, mở ra khả năng phát triển và ứng dụng phƣơng pháp CE – C4D rộng rãi hơn.
Hƣớng phát triển của đề tài:
Do điều kiện hạn chế về thời gian nên luận văn chỉ tiến hành nghiên cứu tách và xác định hàm lƣợng của amlodipin besilat và perindopril tert- butylamin trong mẫu dƣợc phẩm và phân tích Amlodipin besilat trong mẫu nƣớc tiểu. Phƣơng pháp cịn có thể mở rộng nghiên cứu đồng thời Am và Per với các đối tƣợng mẫu khác nhƣ: mẫu nƣớc tiểu, mẫu máu… nhằm phát triển phƣơng pháp hƣớng vào áp dụng cho các vấn đề thực tiễn ở Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng (2010), Nghiên cứu xác định các dạng asen vô cơ trong nước ngầm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên -
ĐHQGHN.
2. Nguyễn Văn Ri (2011), Các kỹ thuật phân tích Điện di, Sách chuyên đề cao học. Đại học khoa học Tự nhiên-ĐHQG Hà Nội.
3. Nguyễn Văn Ri (2011), Các phương pháp tách sắc ký, Sách chuyên đề cao học. Đại học khoa học Tự nhiên-ĐHQG Hà Nội.
4. Lê Thị Hồng Hảo, Phạm Thị Ngọc Mai, Nguyễn Thị Ánh Hƣờng, Nguyễn Vân Anh, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Trang (2016), Ứng dụng phương pháp điện di trong phân tích thực phẩm, Nhà Xuất bản Khoa học và kỹ thuật, năm 2016
5. Phạm Luận (2005), Cơ sở lý thuyết của Sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao, Giáo
trình giảng dạy dành cho sinh viên chuyên ngành Hóa Phân tích, Trƣờng ĐH
Khoa học Tự Nhiên Hà Nội.
6. Tạ Thị Thảo (2010), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, ĐH Quốc gia Hà Nội.
TIẾNG ANH
7. A. Mohammadi, N. Rezanour, M. Ansari Dogaheh, F. Ghorbani Bidkorbeh, M. Hashem, R.B. Walker, (2006), “A stability-indicating high performance liquid chromatographic (HPLC) assay for the simultaneous determination of atorvastatin and amlodipine in commercial tablet”, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, pp. 215–221.
8. A. Zarghi, S.M. Foroutan, A. Shafaati, A. Khoddam, (2005), “Validated HPLC method for determination of amlodipine in human plasma and its application to pharmacokinetic studies”, Farmaco, 60 (9), pp. 789-792.
9. Amlodipin besilat, https://www.thuocbietduoc.com.vn/thuoc-goc-872/amlodipine- besylate.aspx
10. AOAC (2012), “Appendix F: Guidelines for standard method performance requirements”, AOAC official methods of analysis, 9.
11. Azza Abdel Kader Gazy, (2003), “Determination of amlodipine besylate by adsorptive square-wave anodic stripping voltammetry on glassy carbon electrode in tablets and biological fluids”, Talanta, 62, pp. 575–582.
12. B.Venkata Kiran, Battula Sreenivasa Rao and Som Shankar Dubey, (2012), “Simultaneous determination and validation of Amolodipine and Metaprolol in Pharmaceutical Dosage forms by Reverse Phase HPLC Method”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, pp.1-3.
13. Barole. T.C, Gandhi. S.P, Ladke. A. V and Damle. M C, (2011), “Validated HPTLC method for the determination of Amlodipine besylate and Perindopril in bulk and its pharmaceutical dosage form”, The Pharma Review, 26, pp.268-286. 14. Brian De Borba and Jeffrey Rohrer, “Development of an Assay for Besylate in
Amlodipine Besylate by IC and a Second Assay to Simultaneously Determine Amlodipine and Besylate by HPLC”, Thermo Fisher Scientific, pp.1-7.
15. Gabriel Hancu, Monica Budău,Lajos Kristóf Kántor, and Anca Cârje, (2015), “Cyclodextrine Screening for the Chiral Separation of Amlodipine Enantiomers by Capillary Electrophoresis”,Adv Pharm Bull, 5(1), pp. 35-40.
17. H. Greschonig, M. G. Schmid, G. Gubitz (1998), “Capillary electrophoretic separation of inorganic and organic arsenic compounds”, Fres. J. Anal. Chem.
(362), pp. 218-223.
18. Jignesh Prajapati, Ajay Patel1, Dr.M.B.Patel, Nimesh Prajapati,Rashmika Prajapati, (2011), “Analytical method development and validation of Amlodipine besylate and Perindopril erbumine in combine dosage form by RP-HPLC”,
International Journal of PharmTech Research, 3 (2), pp 801-808. 22
19. M. Josefsson, B. Norlander, (1996), “Coupled-column chromatography on a Chiral-AGP phase for determination of amlodipine enantiomers in human plasma: an HPLC assay with electrochemical detection”, J. Pharm. Biomed. Anal, 15, pp. 267–277.
20. Maha A. Hegazy, Samah S. Abbas, Hala E. Zaazaa, Hebatallah M. Essam, (2015), “Conventional univariate Versus multivariate Spectrophotometric assisted Techniques for Simultaneous Determination of Perindopril Arginin and Amlodipine Besylate in presence of their degradation products”, Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 150, pp. 940-948.
21. Mohit. G.D, Kailesh. B.G and Mrinilani. C.D, (2010),“Development and validation of stability indicating HPTLC method for the determination of Perindopril erbumine”, International Research Journal of Pharmacy, 1(1), pp.428-435. 22. Nafisur Rahman, Habibur Rahman, Sk Manirul Haque, (2012), “Kinetic
spectrophotometric method for the determination of perindopril erbumine in pure and commercial dosage forms”, Arabian Journal of Chemistry, pp.1-8.
23. Nafisur Rahman, Habibur Rahman, Sk Manirul Haque, (2012) “Development of spectrophotometric method for the determination of perindopril erbumine in
pharmaceutical formualtions using 2,4-dinitrofluorobenzene”, Journal of the Chilean Chemical Society, pp.1069-1073.
24. Nina Alizadeh, Fatimeh Hemati, (2014), “Spectrophotometric method for the determination of amlodipine besylate in pure and dosage forms using 7,7,8,8- tetracyanoquinodimethane and tetracyanoethylene”, Bulletin of Faculty of Pharmacy, Cairo University, pp.1-6.
25. Nouruddin W. Ali1, Nada S. Abdelwahab1, Marco M. Zaki1 and M. Abdelkawy, (2012), “Validated Chromatographic Methods for Simultaneous Determination of Amlodipine Besylate and Perindopril Arginine in Binary Mixtures and inPharmaceutical Dosage Form”, Chromatography Separation Techniques, 3, pp. 1-5.
26. P. MikuSˇ , K. Mara´kova´, I. Vala´sˇkova´, E. Havra´nek, (2008), “Determination of amlodipine enantiomers in pharmaceuticals using capillary electrophoresis separation and diode array detection”, Pharmazie, 64, pp. 76-79.
27. Perindopril tert – butylaim, https://www.thuocbietduoc.com.vn/thuoc-goc- 132/perindopril-tert-butylamin.aspx
28. Prameela Rani. A1, Bala Sekaran.C, (2009), “A validated RP-HPLC method for the determination of perindopril erbumine in pharmaceutical formulation”
International Journal of PharmTech Research, 1, pp. 575-578.
29. R. M. Guijt, C. J. Evenhuis, M. Macka, P. R. Haddad (2004), “Conductivity detection for conventional and miniaturised capillary electrophoresis systems”,
Electrophoresis (25), pp. 4032-4057.
30. Ratnaparkhi Mukesh, Patil Pradeep, Jagadale Sachin, (2013), “Development and Validation of Spectrophotometric Method for the Determination of Perindopril
Erbumine in Bulk Dosage Form”, American Journal of Phytomedicine and Clinical Therapeutics , pp.78-82.
31. Samia M. El-Gizawy,a Osama H. Abdelmageed,bc Sayed M. Derayea,c Mahmoud A. Omarc and Ahmed M. Abdel-Megied, (2013), “Chiral separation of perindopril erbumine enantiomers using high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis”, Royal society of chemistry, 6, pp. 825-830
32. Yanfen Wei, Hao Wang, Shuangjiao Sun, Lifu Tang, Yupin Cao, Biyang Deng, (2016), “An ultrasensitive electrochemiluminescence sensor based on reduced graphene oxide-copper sulfide composite coupled with capillary electrophoresis for determination of amlodipine besylate in mice plasma”,Biosens
Bioelectron,(86), pp. 714-719.
33. Z. Simonci ˇ cˇ, R. Roskar ˇ, A. Gartner , K. Kogej , V. Kmetec, (2008), “The use of microcalorimetry and HPLC for the determination of degradation kinetics and thermodynamic parameters of Perindopril Erbumine in aqueous solutions”,Int J Pharm,365, pp. 200-205.
PHỤ LỤC
Hình 4.1.Điện di đồ định hàm lƣợng Amlodipin besilat và Perindopril tert- butylamin có trong mẫu thuốc Coveram bằng phƣơng pháp CE-C4D
200 180 160 140 120 100 80 60 t (s) Amlodipin Perindopril Coveram 10 mV
Điều kiện bơm mẫu: mao quản silica có đƣờng kính là 50 µm với tổng chiều dài (Ltot) 55 cm (Leff=4 0cm). Điện thế tách -1C5 kV, thời gian bơm mẫu 30 s, chiều cao bơm mẫu 25 cm, hệ đệm điện di Tris/ace ở pH = 8.
Hình 4.2.Điện di đồ xác định hàm lƣợng Perindopril tert-butylamin có trong mẫu thuốc Covesyl bằng phƣơng pháp CE-C4D
200 180 160 140 120 100 80 t (s) Coversyl Perindopril 10 mV
Điều kiện bơm mẫu: mao quản silica có đƣờng kính là 50 µm với tổng chiều dài (Ltot) 55 cm (Leff=4 0cm). Điện thế tách -15 kV, thời gian bơm mẫu 30 s, chiều cao bơm mẫu 25 cm, hệ đệm điện di Tris/ace ở pH = 8.
Hình 4.3.Điện di đồ xác định hàm lƣợng Amlodipin besilat có trong mẫu thuốc Amlodipin bằng phƣơng pháp CE-C4D
160 140 120 100 80 60 t (s) Amlodipin Amlodipin 10 mV
Điều kiện bơm mẫu: mao quản silica có đƣờng kính là 50 µm với tổng chiều dài (Ltot) 55 cm (Leff=4 0cm). Điện thế tách -15 kV, thời gian bơm mẫu 30 s, chiều cao bơm mẫu 25 cm, hệ đệm điện di Tris/ace ở pH = 8.
Hình 4.4. Điện di đồ xác định hàm lƣợng Amlodipin besilat có trong mẫu thuốc Ambelin bằng phƣơng pháp CE-C4D
620 600 580 560 540 520 t (s) Ambelin Amlodipin 10 mV
Điều kiện bơm mẫu: mao quản silica có đƣờng kính là 50 µm với tổng chiều dài (Ltot) 55 cm (Leff=4 0cm). Điện thế tách -15 kV, thời gian bơm mẫu 30 s, chiều cao