Hình 1 .1 Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản
Hình 1.3 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản
1.3.3. Dòng điện di thẩm thấu (EOF)
Dòng EOF là một loại của dòng chảy khối của chất lỏng trong mao quản. Nó có quan hệ mật thiết với lớp điện tích trên thành mao quản. Dịng EOF đóng vai trò quan trọng trong việc xác định thời gian tồn tại của chất tan ở trong ống mao quản.
Dòng EOF di chuyển từ cực dƣơng sang cực âm, dƣới tác dụng của điện trƣờng, các cation di chuyển cùng chiều với dịng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngƣợc lại các anion di chuyển ngƣợc chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần tử trung hịa khơng chịu tác động của điện trƣờng nên di chuyển cùng tốc độ với dịng EOF.
Hình 1.4: Ảnh hưởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong q trình điện di
Do vậy, để có đƣợc hiệu quả tách cao cần thiết phải tìm đƣợc điều kiện tối ƣu và/hoặc sử dụng các biện pháp kiểm tra và k hống chế (nhƣ thêm các chất hoạt hóa,
thay đổi bề mặt mao quản…) sao cho dịng EOF có cƣờng độ phù hợp với chất phân tích trong điều kiện nghiên cứu cụ thể [1].
1.3.4. Detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE–C4D) trong phƣơng pháp điện di mao quản
Detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE–C4D) trong phƣơng pháp điện di mao quản
Trong phƣơng pháp điện di mao quản, detector đo độ dẫn là một trong những loại detector rất đƣợc chú ý, tuy có độ nhạy thấp hơn so với hai kĩ thuật điện hóa khác nhƣng lại có ƣu điểm là detector đa năng có thể dùng cho rất nhiều loại chất phân tích khác nhau. Detector này có thể thu nhỏ, thuận lợi khi kết hợp với các mao quản có đƣờng kính hẹp, thậm chí với các microchip mà khơng ảnh hƣởng đến độ nhạy và các tính chất khác của detector.
Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D) với thiết kế hai điện cực đồng trục xuất hiện lần đầu trên thế giới vào năm 1998. Dựa trên thiết kế này, năm 2002 nhóm nghiên cứu của GS Peter Hauser (khoa Hóa, trƣờng đại học Basel, Thụy Sỹ) đã phát triển thành công dòng sản phẩm C4D với nguồn điện thế kích thích xoay chiều cao (HV-C4D, 200V). Hãng điện tử eDAQ của Úc sau đó đã phối hợp cùng nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser để phát triển dòng sản phẩm C4D thƣơng phẩm dựa trên nghiên cứu này.
- Nguyên lý hoạt động C4D
Hình 1.5: Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc
Hai điện cực hình ống đƣợc đặt nối tiếp đồng trục bên ngoài mao quản có chứa dung dịch cần đo. Hai điện cực hình ống tạo với dung dịch bên trong mao quản hai tụ điện C. Khoảng dung dịch nằm giữa hai điện cực đóng vai trị nhƣ một điện trở R.
Nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) đƣợc áp vào điện cực thứ nhất. Tại điện cực thứ hai, tín hiệu đo đƣợc ở dạng cƣờng độ dòng điện (I). Theo đó, dịng điện thu đƣợc tại điện cực thứ 2 sẽ phụ thuộc vào độ lớn của điện thế V và tần số f.
Tín hiệu đầu ra thu đƣợc ở dạng cƣờng độ dòng điện (xoay chiều), sau đó sẽ đƣợc chuyển đổi và khuếch đại thành tín hiệu dạng vôn thế (xoay chiều), thông qua việc sử dụng một điện trở khuếch đại (Rfeedback). Vôn thế xoay chiều sau đó đƣợc chuyển đổi thành vôn thế 1 chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau cùng chuyển đổi thành tín hiệu số hóa trƣớc khi đƣợc hiển thị và lƣu trữ trên máy tính.
dung dịch đo nhờ lợi dụng tính chất kết nối tụ điện với dung dịch bên trong mao quản hoặc ống phản ứng. Đây là một cách rất thông minh loại trừ ảnh hƣởng của điện thế cao trong quá trình phân tách điện di đến hệ điện tử của detector và không làm nhiễm bẩn dung dịch phân tích.
1.3.4. Dung dịch đệm pH và pha động trong phƣơng pháp điện di mao quản
Dung dịch đệm quyết định độ linh động điện di của các chất phân tích. Do yếu tố pH, loại dung dịch đệm mà trong đó, các ion và phân tử axit hay bazơ trong thành phần của dung dịch đệm góp phần tạo nên lực ion của chúng. Hơn nữa, chúng cũng ảnh hƣởng đến độ tan, tốc độ phản ứng của các chất [2].
Bảng 1.2. Các chất thƣờng dung làm pha động trong CE và giá trị pK của chúng [4]
1.3.5. Kỹ thuật bơm mẫu trong phƣơng pháp điện di mao quản
Trong điện di mao quản có ba phƣơng pháp thƣờng dùng nạp mẫu phân tích vào trong mao quản, bao gồm:
- Phƣơng pháp thủy động lực học dùng áp suất - Phƣơng pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông
- Phƣơng pháp điện động học
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu xác định amlodipin besilat (Am) và perindopril tert-butylamin (Per) trong mẫu dƣợc phẩm và phân tích Am trong mẫu nƣớc tiểu bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE – C4D).
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu khảo sát tối ƣu các điều kiện tách amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin bằng phƣơng pháp điện di mao quản CE-C4D
Điều kiện phân tích của thiết bị: Cố định một số điều kiện nhƣ chiều dài mao quản, đƣờng kính mao quản và thế tách.
Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần hệ đệm, nồng độ đệm và pH của dung dịch đệm.
Khảo sát thời gian bơm mẫu Khảo sát chiều cao bơm mẫu - Thẩm định phƣơng pháp phân tích
Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đƣờng chuẩn
Xác định giới hạn phát hiện LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ). Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp phân tích
- Nghiên cứu khảo sát các điều kiện tối ƣu cho việc xử lý mẫu nƣớc tiểu bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng sau đó tiến hành đo bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE – C4D), gồm:
Khảo sát dung môi chiết
Khảo sát pH của môi trƣờng chiết Khảo sát thể tích dung mơi chiết. Khảo sát đệm.
Khảo sát thời gian lắc chiết
- Áp dụng quy trình phân tích mẫu thực tế: mẫu dƣợc phẩm và mẫu nƣớc tiểu của ngƣời bệnh uống thuốc.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp khảo sát xác định các điều kiện thích hợp
Khảo sát điều kiện phân tích tối ƣu đƣợc thực hiện trên thiết bị CE-C4D với mao quản có chiều dài 55 cm, đƣờng kính trong 50 µm, thế áp vào hai đầu mao quản -15 kV. Các điều kiện này giữ nguyên trong tất cả các thí nghiệm. Các điều kiện cần khảo sát gồm: dung dịch đệm điện di, chiều cao và thời gian bơm mẫu. Việc khảo sát đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp đơn biến, thay đổi một thành phần trong khi cố định các thành phần còn lại để thu đƣợc điều kiện tối ƣu nhất.
2.2.1.1. Khảo sát dung dịch đệm điện di
Với hỗn hợp chất phân tích amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin, dung dịch đệm điện di đƣợc khảo sát bằng cách thay đổi thành phần hệ đệm, pH và nồng độ đệm tại thế tách -15 kV, bơm mẫu ở độ cao 20 cm trong 30 s.
Việc khảo sát pH đƣợc thực hiện trong khoảng pH từ 4, 5, 6, 7, 8 đến 9. Điều chỉnh pH bằng máy đo pH trên cơ sở giữ nguyên nồng độ hợp phần bazơ và thêm hợp
Thành phần hệ điện di thay đổi với 3 hệ đệm Tris/ace, Tris/asc, Arg/ace. Trong đó giữ nguyên nồng độ hợp phần bazơ (Tris, Arg) 10mM và dùng hợp phần acid (Ace, Asc) điều chỉnh đến pH 8.
Nồng độ đệm điện di đƣợc khảo sát ở các mức nồng độ 7 mM, 10 mM và 15 mM với hệ đệm Tris/ace ở pH = 8.
2.2.1.2. Khảo sát thời gian bơm mẫu
Khảo sát thời gian bơm mẫu bằng cách giữ nguyên các điều kiện khảo sát đƣợc tối ƣu thu đƣợc ở các thí nghiệm khác và thay đổi thời gian bơm 10 s, 20 s, 30 s và 50 s.
2.2.1.3. Khảo sát chiều cao bơm mẫu
Chiều cao bơm mẫu đƣợc thực hiện ở các mức 15 cm, 20 cm, 25 cm, 28 cm với các điều kiện đã tối ƣu khảo sát ở trên.
2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu
2.2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu thuốc
Các mẫu dƣợc phẩm đƣợc mua ở các cửa hàng thuốc ở Hà Nội và đƣợc bảo quản trong q trình phân tích. Thơng tin về các mẫu dƣợc phẩm phân tích đƣợc nêu trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thông tin và đặc điểm của từng loại mẫu dƣợc phẩm
Tên thuốc Đặc điểm Xuất xứ Hàm lƣợng
Coveram Dạng viên, 30 viên/lọ Servier Ireland Industries Ltd (số lô: 234410 , hạn dùng: 10/2019)
Mỗi viên thuốc chứa 5 mg amlodipin besilat và 5mg perindopril tert butylamin trong 1 viên nén, còn lại là tá dƣợc
Coversyl Dạng viên, 30 viên/ lọ
Les laboratoires servier Industries (số lô: 619010, hạn dùng:
03/2020)
Mỗi viên thuốc chƣa chứa 5mg perindopril tert butylamin trong 1 viên nén, còn lại tá dƣợc Ambelin Dạng viên, 10 viên/ vỉ Công ty TNHH liên doanh HASAN – DEMAPHARM (số lô: 00416, hạn dùng: 11/2019)
Mỗi viên thuốc chƣa chứa 5mg amlodipin besilat trong 1 viên nén, còn lại tá dƣợc Amlodipin Dạng viên, 10 viên/ vỉ Công ty CP Dƣợc Trung Ƣơng VIDIPHA(số lô: 721116 , hạn dùng: 11/2019)
Mỗi viên thuốc chƣa chứa 5mg amlodipin besilat trong 1 viên nén, còn lại là tá dƣợc
2.2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu nước tiểu
Mẫu nƣớc tiểu đƣợc lấy từ 3 ngƣời bệnh có tiền sử bệnh huyết áp mãn tính và đang sử dụng thuốc có chứa hoạt chất amlopidin ở 3 thời điểm liên tiếp 10h, 12h, 14h sau khi sử dụng thuốc.
Vì các mẫu nƣớc tiểu thƣờng có nền mẫu phức tạp và hàm lƣợng thuốc trong nƣớc tiểu thƣờng nhỏ nên cần đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng để làm giàu mẫu và loại bỏ 1 phần các tạp chất trƣớc khi bơm mẫu vào thiết bị CE.
Phƣơng pháp chiết lỏng lỏng là kĩ thuật chiết cho chất phân tích tan ƣu tiên vào một trong hai pha lỏng không trộn lẫn, còn tạp chất và các chất cần tách khác ở lại trong pha kia, từ đó tách chất phân tích ra khỏi nền hoặc các tạp chất ra khỏi chất phân tích [3].
Các bƣớc chiết lỏng – lỏng:
2.3. Hóa chất và thiết bị 2.3.1. Hóa chất 2.3.1. Hóa chất
Các hóa chất dùng trong phƣơng pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích
2.3.1.1. Chất chuẩn
Amlodipin besilat (SKS: 0415019, hàm lƣợng 100,04% (nguyên trạng), Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng),
Perindopril tert-butylamin (SKS: 0107210, hàm lƣợng 100,0% (nguyên trạng), Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng).
2.3.1.2. Hóa chất dung mơi
Hóa chất loại tinh khiết phân tích: L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lƣợng > 99,5%); L- Histidine (C6H9N3O2) (Fluka, hàm lƣợng 99,5%); Tris, axit axetic
Lấy 5ml nƣớc tiểu vào ống nghiệm
Kiềm hóa mẫu về pH 9 bằng dung dịch NH3 ( kiểm tra bằng giấy quỳ)
Chiết mẫu bằng 3ml n-butyl aceat lắc trong 20 phút
Ly tâm cho tách lớp
Hút lớp n-butyl acetat ( lớp trên) đuổi dung mơi bằng khí N2, đƣợc cặn chiết
(CH3COOH), axit clohydric (HCl), axit ascobic (C6H8O6), natri hydroxyd (NaOH), methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức)
Nƣớc đêion: Bộ lọc nƣớc của hãng Scientech (Mỹ)
2.3.1.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất
Pha dung dịch chuẩn gốc
Amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin đƣợc pha trong dung mơi là methanol:
Cân chính xác 25,00 mg (amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin) mỗi loại chuyển vào bình định mức 25,00 ml. Thêm 5,00 ml methanol và đem rung siêu âm trong 30 phút, sau đó định mức tới vạch bằng nƣớc đề-ion thu đƣợc dung dịch gốc có nồng độ 1000,00 ppm. Dung dịch đƣợc bảo quản trong tủ lạnh từ 2- 8ºC, tránh ánh sáng và có thể sử dụng trong vòng 3 tháng.
Từ dung dịch chuẩn trên ta có thể pha các dung dịch chuẩn làm việc có các nồng độ khác nhau nhƣ dung dịch chuẩn: 200,00; 150,00; 100,00; 60,00; 50,00; 40,00; 20,00; 10,00; 5,10 ppm…Các dung dịch làm việc đƣợc pha hàng ngày.
Pha dung dịch đệm
Các dung dịch đệm điện di đƣợc cân và pha trực tiếp vào bình định mức bằng nƣớc đề-ion. Tất cả các dung dịch đều đƣợc rung siêu âm và chuẩn lại giá trị pH trƣớc khi sử dụng. Dung dịch đệm đƣợc pha mới hàng ngày.
2.3.2. Thiết bị dụng cụ
Thiết bị:
Thiết bị CE-C4D đƣợc thiết kế và chế tạo bởi công ty 3S Analysis (http://www.3sanalysis.vn/) phối hợp với nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (khoa Hóa Học, trƣờng đại học Basel, Thụy Sỹ). Đây là thiết bị điện di mao quản dạng xách
tay, lần đầu tiên trên thế giới sử dụng nguồn thế cao mini của hãng Spellman với điện thế cực đại lên đến 20kV – (Các thiết bị này sẽ đƣợc cơng bố trên các tạp chí quốc tế trong thời gian sắp tới). Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối theo kiểu tụ điện (C4D) đƣợc thiết kế ở dạng thu nhỏ, với nguồn kích thích 200V, với hai điện cực hình ống đồng trục có chiều dài 4mm, và đƣờng kính 400 µm đặt cách nhau 1mm. Tấm chắn Faraday (nối đất) đƣợc sử dụng để ngăn cách hai điện cực.
Hình 2.1: Ảnh chụp thiết bị CEC4D triển khai tại Việt Nam 1: Hộp thế 1: Hộp thế
2: Điều khiển cao thế 3: Detector
4: Ống dẫn dung dịch đệm 5: Nút điều chỉnh
6: Bộ phận điều khiển 7: Hộp khí
Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521 Bộ lọc nƣớc đêion của hãng Scientech (Mỹ)
Máy đo pH của hãng HANNA với điện cực thủy tinh và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH
Cân phân tích của hãng Scientech (Mỹ), độ chính xác 0,0001 g Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu
Máy ly tâm LCEN-200
Dụng cụ
Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, cốc thủy tinh
Pipet pasteur với các cỡ khác nhau: 20; 200 và 1000 µl và đầu tip tƣơng ứng Các bình định mức nhựa polypropylen (PP) 25 và 100 ml đƣợc sử dụng để pha
các dung dịch gốc của các chất phân tích và các dung dịch đệm
Các lọ Falcon 15 ml và lọ polypropylen (PP) để đựng các dung dịch chuẩn Đầu lọc có đƣờng kính lỗ lọc 0,45 µm
Các xy lanh lọc để lọc mẫu
Mao quản đƣờng kính trong 50 µm, chiều dài 55 cm Các dụng cụ thơng thƣờng khác của phịng thí nghiệm
2.4. Các thơng số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích
2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp phân tích. phân tích.
- Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Đối với các q trình sắc ký, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3 [4].
- Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với
tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền. Thơng thƣờng, với các quá trình sắc ký giá trị LOQ đƣợc xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10 [4].
2.4.2. Độ chụm (độ lặp lại) của phƣơng pháp
Độ lặp lại đặc trƣng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi tiến hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, đƣợc tiến hành bằng một phƣơng pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (cùng ngƣời phân tích, cùng trang thiết bị, phịng thí nghiệm, trong các khoảng thời gian ngắn) [6].
Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%)
Cơng thức tính độ lêch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) nhƣ sau [19]: 1 2 n S S SD i tb (2.3) % x100 S SD RSD tb (2.4) Trong đó:
- Si là diện tích của pic điện di thứ i - Stb là diện tích trung bình của n lần chạy - n là số lần chạy lặp (n =6)
2.4.3. Độ đúng (độ thu hồi) của phƣơng pháp
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí