CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Khảo sát mức độ biểu hiện của BBAP trong tế bào da thƣờng và các tế bào ung
dòng tế bào ung thƣ
Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng biểu hiện của BBAP trong các dòng tế bào ung thƣ da (melanoma cells) khác nhau để tìm dịng tế bào có biểu hiện BBAP cao nhất, so sánh với dòng tế bào da thƣờng (melanocyte – NHEM). Mục đích của khảo sát này để tìm kiếm các dịng tế bào ung thƣ da có biểu hiện BBAP cao và thấp hơn trong điều kiện bình thƣờng để tiến hành tách chiết gen mã hóa BBAP (đối với dịng tế bào có biểu hiện cao) và lựa chọn dịng tế bào có thế biến nạp vector tái tổ hợp tăng cƣờng làm khả năng biểu hiện BBAP (đối với dòng tế bào có biểu hiện thấp hơn). Phân tích định lƣợng gen và protein BBAP trong tế bào da bình thƣờng (melanocyte) và trong các dòng tế bào ung thƣ hắc tố (melanoma) ở ngƣời bằng realtime PCR và Western Blot thu đƣợc kết quả nhƣ sau (hình 3.2a và hình 3.2b)
Trong hai thí nghiệm khảo sát này, chúng tôi xem giá trị quy đổi của đối chứng là 1, cịn các giá trị của các thí nghiệm khác sẽ so với đối chứng (bằng 1), để xem giá trị thí nghiệm đó tăng lên hay giảm đi bao nhiêu lần so với đối chứng. Điều này cũng có nghĩa là đơn vị trục tung đã bị triệt tiêu. Cụ thể trong trƣờng hợp so sánh biểu hiện của BBAP trong các mô u lành hoặc tế bào da thƣờng và mơ ung thƣ hoặc các dịng tế bào ung thƣ khác nhau, giá trị biểu hiện của BBAP trong mô u lành và tế bào da thƣờng đƣợc coi là đối chứng và quy về 1, còn biểu hiện của BBAP trong mơ ung thƣ và các dịng tế bào ung thƣ sẽ cao hay thấp hơn bao nhiêu lần so với 1.
Tỉ lệ so sánh tƣơng đối (với NHEM)
Hình 3.2a. BBAP biểu hiện ở mức độ phiên mã trong tế bào da thường (NHEM) và các dịng tế bào ung thư
Hình 3.2b. Mức độ biểu hiện của protein BBAP trong tế bào da thường (NHEM) và các dòng tế bào melanoma.
1-NHEM, 2-SKMEL28, 3-Skmel-37, 4-A375P, 5-A375M, 6-MNT-1, 7-G361, 8-HMV-II, M-Marker α - tubulin BBAP 175KDa 80 KDa 58KDa M 1 2 3 4 5 6 7 8 Các dòng tế bào melanoma
SKMEL28 Melanoma G361 Melanoma MNT1 Melanoma SK Mel 37 Melanoma A375P Melanoma A375M Melanoma
A431 Squamous carcinoma
HSC5 Squamous carcinoma
A549 Lung carcinoma
A172 Glioblastoma
TGW Neuroblastoma
THP Monocytic leukemia
NALM6 Pre-B lymphoma
RAJI Lymphoma
MCF7 Beast cancer
AZ521 Stomach cancer
SV480 Colon adenocarcinoma
8050C Thyroid cancer
HT1080 Fibrosarcoma
HEPG2 Hepatocellular liver carcinoma
Mức độ biểu hiện của gen BBAP trong các dòng tế bào melanoma (SKMEL28, A375P, A375M, G361, SKMEL 37 và MNT 1) cao hơn trong tế bào da thƣờng (melanocyte - NHEM) từ 2,83 – 15,31 lần.
Sự khác nhau giữa mức độ biểu hiện của BBAP ở các dòng tế bào melanoma và các dịng tế bào khơng phải melanoma ở mức độ phiên mã có thể do liên quan đến thụ thể vitamin D. Hoạt động của thụ thể này đòi hỏi việc tu sửa nhiễm sắc thể để tạo điều kiện tiếp cận với các trình tự promoter điều tiết, liên kết trực tiếp của sự sửa đổi protein Histone với promoter của các yếu tố đáp ứng sự thay đổi hormon steroid. Gần đây, có một số báo cáo đã chỉ ra rằng các chất hoạt hóa và ức chế cùng nhau tƣơng tác với thụ thể vitamin D bao gồm HATs và HDs [11]. Những sự sửa đổi này đã đƣợc tìm thấy trong q trình acetyl hóa của các protein Histone trong các nucleosome liên kết với chuỗi promoter của thụ thể vitamin D [11]. Phát hiện này mang lại một cái nhìn rất có giá trị trong việc nghiên cứu các thay đổi về liên kết hóa học của sự tổ chức và thay thế các nucleosome với sự kiểm sốt của q trình phiên mã. Q trình acetyl hóa trung hịa điện tích dƣơng của dƣ lƣợng lysine và phá vỡ sự liên kết của các phức hoạt hóa HAT với chuỗi promoter của thụ thể hormon steroid liên quan. Các bằng chứng in vivo đã chứng minh vai trị quan trọng của q trình acetyl hóa các protein Histone trong hormon steroid gây ra việc kích hoạt gen và các đồng yếu tố acetyl hóa có liên quan trong các tín hiệu hormon nội bào [15].
Mức độ biểu hiện của protein BBAP trong các dòng tế bào melanoma cao hơn rõ rệt so với trong các tế bào da thƣờng (NHEM), đặc biệt là trong các dòng tế bào SKMEL 28, SKMEL 37, và A375P (hình 3.1d).
Từ hai kết quả này, chúng tơi quyết định tiến hành các thí nghiệm tạo dịng tế bào tái tổ hợp có biểu hiện tăng cao BBAP để nghiên cứu vai trò của BBAP trong sự phát sinh và phát triển melanoma.
Từ hai kết quả trên, dòng tế bào SKMEL 28 đƣợc lựa chọn để nuôi cấy, tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA. Phản ứng PCR khuếch đại gen BBAP đƣợc thực hiện bằng cặp mồi 1 (bảng 1), sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% để xác định kích thƣớc, kích thƣớc đoạn gen mong muốn là 2,2Kb (hình 3.2c)
Hình 3.2c. Kiểm tra kích thước đoạn gen BBAP bằng điện di