CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Tạo dòng tế bào nhân dòng mang gen BBAP
Sản phẩm PCR với kích thƣớc mong muốn đƣợc cắt cùng gel agarose, xử lý thôi gel và tinh sạch sản phẩm.
Vector pGEMT easy đƣợc xử lý cắt mở vòng bằng một enzymee cắt giới hạn sau đó đƣợc ủ cùng sản phẩm PCR sau tinh sạch cùng với enzymee T4 ligase để tiến hành cài sản phẩm PCR vào vector pGEMT easy tạo thành vector nhân dòng tái tổ hợp. Hỗn hợp này đƣợc sử dụng để biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α
bằng phƣơng pháp sốc nhiệt.
Dòng tế bào vi khuẩn E.coli DH5α sau khi sốc nhiệt đƣợc tiến hành cấy trải trên mơi trƣờng LB thạch có bổ sung IPTG 0,1mM/X-gal 2% và Ampicillin 100mg/ml (hình 3.2a)
M P
M: Marker 2Kb
Từ đĩa nuôi cấy, 15 khuẩn lạc trắng đƣợc thu nhận và tiến hành tách DNA tổng số để kiểm tra khả năng mang vector tái tổ hợp bằng phƣơng pháp PCR. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8%, kết quả nhƣ sau (hình 3.2b)
Hình 3.3b. Kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp trong các khuẩn lạc trắng 1 – 15: Sản phẩm PCR từ 15 khuẩn lạc trắng
M: Marker 100bp
Hình ảnh điện di cho thấy trong số 15 khuẩn lạc đƣợc lựa chọn để kiểm tra, chỉ có duy nhất một khuẩn lạc số 2 (tƣơng ứng với đƣờng chạy số 2) là khơng mang
Hình 3.3a. Hình thái và màu sắc khuẩn lạc phát triển trên môi trường chọn lọc. Các khuẩn lạc có màu trắng được lựa chọn để tiến hành kiểm tra khả năng mang vector tái tổ hợp. 2200bp 5000bp 2000bp 1000bp 500bp 100bp
vector tái tổ hợp chứa gen BBAP mong muốn (với kích thƣớc mong muốn là 2,2Kb). Với kết quả này, 14 khuẩn lạc thành cơng trong việc nhân dịng đƣợc chuyển tới các thí nghiệm sau.
3.4. Tạo dòng tế bào biểu hiện gen BBAP
Trong số 14 khuẩn lạc nêu trên, lựa chọn 8 khuẩn lạc đƣa vào nuôi cấy trên môi trƣờng LB lỏng. Sau đó thu sinh khối tế bào và tiến hành tách chiết DNA.
Vector biểu hiện pCMVFa tagged đƣợc xử lý mở vòng và ủ với DNA sau tinh sạch cùng với enzymee T4 ligase tạo vector biểu hiện tái tổ hợp pCMVFa-BBAP
Vector biểu hiện tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α và
nuôi cấy trên mơi trƣờng LB thạch, có bổ sung IPTG 0,1mM/X-gal 2% và Ampicillin nồng độ 100mg/ml. Tiến hành chọn lọc khuẩn lạc xanh – trắng
Tám khuẩn lạc trắng đƣợc lựa chọn từ đĩa nuôi cấy, tiến hành xử lý thành tế bào và chạy PCR trực tiếp bằng cặp mồi số 2 (bảng 1) để xác định sự có mặt của gen BBAP. Kết quả điện di thu đƣợc nhƣ hình 3.4a
Hình 3.4a. Kiểm tra sự có mặt của gen BBAP có trong khuẩn lạc (colony) trắng
Kết quả này cho thấy, cả 8 khuẩn lạc (tƣơng ứng với các đƣờng chạy 1 – 8) đều xuất hiện băng có kích thƣớc lớn hơn 2Kb, tuy nhiên ở 4 đƣờng chạy cuối (tƣơng ứng với các khuẩn lạc 5, 6, 7 và 8), kích thƣớc băng thấp hơn và khơng sắc nét nhƣ ở 4 đƣờng chạy đầu tiên – tƣơng ứng với các khuẩn lạc từ 1 – 4. Để kiểm tra các sản phẩm này, hai khuẩn lạc số 2 và số 7 đƣợc lựa chọn để nuôi cấy lỏng, thu sinh khối và tách chiết DNA. DNA sau tách chiết của hai khuẩn lạc này đƣợc kiểm tra bằng hai hệ thống enzyme cắt giới hạn EcoRI/XhoI và BamHI/XhoI. Kết quả thu đƣợc từ khuẩn lạc số hai đƣợc thể hiện nhƣ hình 3.3b. Với hệ enzyme EcoRI/XhoI, kết quả mong muốn thu đƣợc ba băng có kích thƣớc tƣơng ứng 4,8Kb, 1,8Kb và 0,5Kb do
EcoRI cắt tại hai vị trí – một trên vector và một trên BBAP. Với hệ enzyme BamHI/XhoI, kết quả mong muốn thu đƣợc hai băng có kích thƣớc lần lƣợt 4,8Kb
và 2,2Kb. Chứng dƣơng là sản phẩm DNA không xử lý với enzyme và chứng âm là vector pCMVFa có kích thƣớc khoảng 4,8Kb. Khuẩn lạc số 2 cho kết quả nhƣ mong đợi (hình 3.3b), cịn khuẩn lạc số 7 khơng cho kết quả mong muốn (kết quả không đƣợc ghi nhận) Colony 1 2 3 4 5 6 7 8 M 2000 bp 1000 bp 500 bp 100 bp 2200 bp
Hình 3.4b. Kiểm tra sự có mặt của gen BBAP trong vector biểu hiện
Sau đó, để xác nhận sự có mặt của gen BBAP trong vector biểu hiện pCMVFa, chúng tơi tiến hành giải trình tự gen. Kết quả giải trình tự một lần nữa xác nhận BBAP đã đƣợc cài xen thành cơng vào vector pCMVFa.
Kết quả giải trình tự gen BBAP, để chứng minh thực sự gene BBAP đã đƣợc chèn vào vector biểu hiện pCMV Fa.
M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M. Marker 1. cắt tại 3 điểm 3 mảnh 2. cắt tại 2 điểm 2 mảnh (1 vector + 1 BBAP) 3. không cắt 1 mảnh Chứng dƣơng 4. vector pCMVFa Chứng âm
Trình tự gene BBAP
3.5. Tạo dịng tế bào có biểu hiện BBAP thấp (G361) mang plasmid tái tổ hợp chứa gen BBAP và quan sát ảnh hƣởng của BBAP
Từ kết quả khảo sát sự biểu hiện của BBAP trong các dòng tế bào khác nhau (hình 3.2c), G361 là dịng tế bào melanoma có biểu hiện BBAP nội sinh yếu đƣợc lựa chọn làm dòng tế bào để biến nạp vector biểu hiện tái tổ hợp pCMVFa-BBAP bằng lipofectaminTMLTX. Tế bào sau khi biến nạp đƣợc nuôi trong môi trƣờng DMEM (Dulbecco’s ModiWed Eagle’s Medium) chứa 10% FBS (Fetal Bovine Serum), bổ sung 1% Penicillin/Streptomycin, ủ ở 37oC, có CO2 5%, thu protein tổng số. Để xác nhận sự hiện diện của protein BBAP tái tổ hợp trong tế bào G361 sau biến nạp, mẫu protein đƣợc sử dụng chạy Western Blot với kháng thể kháng
BBAP đặc hiệu và kháng thể kháng Flag-target, protein β-actin đƣợc sử dụng nhƣ một đối chứng. Kết quả thể hiện ở hình 3.5
(a) (b)
Hình 3.5. Kiểm tra sự có mặt của BBAP trong tế bào G361 bằng WB. (a) Sử dụng kháng thể kháng BBAP;
(b) sử dụng kháng thể kháng Flag. β-actin là protein đối chứng
Kết quả tại hình 3.5(a) cho thấy 03 dịng tế bào G361 đƣợc biến nạp vector tái tổ hợp pCMVFa-BBAP (clone 2, clone 3, clone 4) có mức độ biểu hiện BBAP tăng cao rõ rệt so với dòng tế bào đối chứng âm (N và Mock – là các dòng tế bào G361 không đƣợc biến nạp vector tái tổ hợp hoặc chỉ biến nạp vector pCMVFa. Clone 1 là dịng tế bào đối chứng dƣơng có biểu hiện cao BBAP đƣợc sử dụng để so sánh và và xác nhận băng đích. Hình 3.5(b) cho thấy sự biểu hiện của Flag trong vector tái tổ hợp. Hệ thống vector Flag sử dụng một đoạn ngắn là một chuỗi peptide gồm 8 amino axit ƣa nƣớc (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) đƣợc hợp nhất với protein tái tổ hợp quan tâm – BBAP – khi biểu hiện từ một vector pFlag. Chính vì vậy, ở các dòng tế bào G361 không mang vector tái tổ hợp và chỉ mang vector
BBAP -Actin -Actin N M o ck Clo n e 1 (p o sit ive cont ro l) Clo n e 2 C lo n e 3 Clo n e 4 N M o ck Clo n e 1 (p o sit ive cont ro l) Clo n e 2 Clo n e 3 Clo n e 4 Flag-BBAP
pCMVFa (N và Mock) không ghi nhận sự biểu hiện của Flag. Các dòng tế bào G361 mang pCMVFa-BBAP (clone2, clone 3 và clone 4) có sự biểu hiện Flag cao.
Kết quả này cho thấy sự thành cơng trong việc tạo dịng tế bào tái tổ hợp có khả năng biểu hiện tăng cƣờng BBAP.
3.6. Khảo sát vai trò của protein BBAP trong sự phát triển melanoma
3.6.1. Khả năng xâm lấn (di căn) trực tiếp
Khả năng xâm lấn trực tiếp của các tế bào G361 mang vector tái tổ hợp và không mang vector tái tổ hợp đƣợc khảo sát thơng qua thí nghiệm trên hệ Boyden Chamber. Các tế bào ở pha môi trƣờng thứ hai (pha bên dƣới) đƣợc nhuộm hematocylin/eosin. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.6.1
Hình 3.6.1 Ảnh hưởng của BBAP lên khả năng xâm lấn của tế bào G361. (*) dồng tế bào đối chứng G361 không mang vector tái tổ hợp. (**) dòng tế bào G361 tái tổ hợp tăng biểu hiện BBAP.
Kết quả cho thấy việc tăng cƣờng mức độ biểu hiện của protein BBAP làm tăng khả năng xâm lấn của tế bào G361 lên gấp 4 lần so với tế bào đối chứng.
(*)
(**)
3.6.2. BBAP tham gia tham gia điều hòa sự xâm lấn (di căn) của tế bào G361 thông qua con đường FAK/AKT. thông qua con đường FAK/AKT.
Để chứng minh cho kết quả về khả năng di căn trực tiếp của tế bào có biểu hiện cao BBAP, chúng tơi tiến hành phân tích mức độ biểu hiện của một số protein quan trọng trong các con đƣờng quyết định khả năng di chuyển, xâm lấn, di căn của tế bào ung thƣ đã đƣợc phân tích bằng kỹ thuật WB.
Hình 3.6.2a. Mức độ biểu hiện protein BBAP (81 KDa).
Đường chạy 1,2- Các dòng tế bào G361đối chứng;
Hình 3.6.2b. Mức độ biểu hiện của protein FAK bị photphat hóa tại vị trí Tyrosine 397 (125 KDa).
Đường chạy 1,2- Các dòng tế bào G361đối chứng;
Đường chạy 3,4- Các dòng tế bào G361 siêu biểu hiện BBAP.
Hình 3.6.2c. Mức độ biểu hiện protein FAK tổng số (125 KDa).
Đường chạy 1,2- Các dòng tế bào G361đối chứng;
Hình 3.6.2d.Mức độ biểu hiện protein AKT bị photphat hóa tại vị trí Threonine 308 (60 KDa).
Đường chạy 1,2- Các dòng tế bào G361đối chứng;
Đường chạy 3,4- Các dòng tế bào G361 siêu biểu hiện BBAP.
Hình 3.6.2e. Mức độ biểu hiện protein AKT tổng số (60 KDa).
Đường chạy 1,2- Các dịng tế bào G361đối chứng;
Hình 3.6.2f. Mức độ biểu hiện protein nội chứng TUBULIN (50 KDa).
Đường chạy 1,2- Các dòng tế bào G361đối chứng;
Đường chạy 3,4- Các dòng tế bào G361 siêu biểu hiện BBAP.
Kết quả phân tích Western Blot cho thấy sự tăng cƣờng biểu hiện của protein BBAP (hình 3.6.2a) làm tăng sự phosphor hóa gốc tysosine 397 trên phân tử FAK (hình 3.6.2b) và gốc threonine 308 trên phân tử AKT (hình 3.6.2d), trong khi đo protein FAK tổng số (hình 3.6.2c) và AKT tổng số (hình 3.6.2e) ít có sự thay đổi và protein TUBULIN (nội đối chứng) có mức độ biểu hiện bằng nhau ở các dịng tế bào quan sát (hình 3.6.2f). Kết quả này cho thấy rằng protein BBAP có khả năng tham gia làm tăng khả năng di căn của các tế bào ung thƣ thông qua khả năng làm tăng cƣờng sự biểu hiện của p-FAK và p- AKT.
KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu thu đƣợc, chúng tôi đƣa ra một số kết luận nhƣ sau Đã thiết kế thành công vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein BBAP.
Đã thành cơng trong việc tạo dịng tế bào G361 có biểu hiện tăng cao BBAP BBAP có khả năng có ảnh hƣởng trực tiếp và gián tiếp đến khả năng xâm lấn, di căn của tế bào ung thƣ melanoma thông qua việc làm tăng sự biểu hiện của p-FAK và p-AKT.
KIẾN NGHỊ
Từ kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng BBAP nên đƣợc xem xét nhƣ là một marker sinh học trong chẩn đoán và theo dõi tiên lƣợng ung thƣ da dạng melanoma và tiến tới đƣợc sử dụng nhƣ một đích tác dụng của thuốc trong việc điều trị căn bệnh này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Trần Đăng Quyết, (2000) Sinh lý Da, Đại học Y Hà nội
2. Nguyễn Duy Phƣơng, Najaren Tuleja, Lê Huy Hàm, Phạm Xuân Hội, (2012),
Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp NLI-IF từ tế bào Escherichia coli,
số 34, quyển 3, trang 347 – 353.
3. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, (2006), Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật), Đại học Huế.
4. Lê Trung Thọ, (2012), Bệnh học U, Đại học Y Hà nội
5. Vũ Thái Hà, Nguyễn Hữu Sáu, Lê Đức Minh, Trần Hậu Khang, Nguyễn Sỹ Hóa, Ngơ Văn Tồn, (2011), Nghiên cứu phân bố các loại ung thư da tại bệnh viện Da liễu Trung Ương giai đoạn 2007 – 2010, Y học thực hành, tập
8, trang 33 – 36.
6. Vũ Thanh Phƣơng, Nguyễn Đại Bình, Bùi Diệu, (2010), Kết quả sống thêm 5
năm sau điều trị triệt căn ung thư hắc tố giai đoạn I – III tại bệnh viện K, Y học TP. Hồ Chí Minh, tập 14, phụ bản của số 4, trang 589 – 595.
Tài liệu Tiếng Anh
7. About melanoma Skin Cancer - A quick Guide, (2014), Cancer Research UK 8. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2015. Atlanta, Ga:
American Cancer Society; 2015.
9. American Joint Committee on Cancer, "Melanoma of the skin", AJCC Cancer
Staging Manual, 7th ed. New York: Springer; 2010, p. 325-344.
10. Annegret Vogl, Ute Sartorius, Thomas Vogt, Alexander Roesch, Micheal Landthaler, Wihelm Stolz, and Bernd Becker, (2005), "Gene Expression Profile Changes between Melanoma Metastases and their Daughter Cell Lines: Implication for Vaccination Protocols", Journal of Investigative Dermatology, Vol 124, p. 401 - 404.
11. Chen, H., Lin, R. J., Xie, W., Wilpitz, D., and Evans, R. M, (1999),"Regulation of hormone-induced histone hyperacetylation and gene
activation via acetylation of an acetylase", Cell, Vol 98, p. 675–686.
12. Christopher Haqq, Mehdi Nosrati, Daniel Sudilovski, Julia Crothers, Daniel Khodabakhsh, Brian L. Pulliam, Scot Federman, James R.Miller III, Robert E.Allen, Mark I.Singer, Stanley P.L. Leong, Britt-Marie Ljung, Richard W. Sagebiel, and Mohammed Kashani-Sabet, (2004), "The gene expression signatures of melanoma progression", PNAS, Vol 102(17), p. 6092 - 6097. 13. Corine Bertolotto, (2013), "Melanoma: From Melanocyte to Genetic
Alterations and Clinical Options", Scientifica, Vol 2013, doi:
10.1155/2013/635203.
14. Ewan A.Gibb, Katey S.S.Enfield, Ivy F.L.Tsui, Raj Chari, Stephan Lam, Carlos E.A, and Wan L.Lam, (2010), "Deciphering Squamous Cell
Carcinoma Using
Multidimensional Genomic Approaches", Journal of Skin Cancer, volume 2011, doi: 10.1155/2011/541405.
15. Gary S.Stein, Martin Montecino, Andre' J.van Wijnen, Janet L.Stein, and Jane B.Lian, (2000), "Nuclear Structure-Gene Expression Interrelationships: Implications for Aberrant Gene Expression in Cancer", Cancer Research,
Vol 60, p. 2067 - 2076.
16. Hideya Ando, Yoko Niki, Massaki Ito, Kaoru Akiyama, Mary S. Matsui, Daniel B. Yarosh, and Masamitsu Ichihashi, (2012), "Melanosomes Are Transferred from Melanocytes to Keratinocytes through the Processes of Packaging, Release, Uptake, and Dispersion", Journal of Investigative Dermatology, Vol 132, p. 1222 - 1229.
17. Ichiro Yajima, Mayuko Y. Kumasaka, Nguyen Dinh Thang, Yuji Goto, Kozue Takeda, Osamu Yamanoshita, Machiko Iida, Nobutaka Ohgami, Haruka Tamura, Yoshiyuki Kawamoto, and Masashi Kato, (2012), "RAS/RAF/MEK/ERK and PI3K/PTEN/AKT Signaling in Malignant Melanoma Progression and Therapy", Dermatology Research and Practice, Vol 2012, doi: 10.1155/2012/354191.
18. J. T´ım´ar, T. Barbai, B. Gy˝orffy, and E. R´as´o, (2013), "Understanding Melanoma Progression by Gene Expression Signatures",Cancer Genomics
Molecular classification, Prognosis and Response Prediction, Chapter 2, p.
47 - 78.
19. Janetta Bensouilah, Philippa Buck, (2006), "Skin Structure and Function",
Aromadermatology, Chapter 1, p.1 - 11.
20. Jin Boo Jeong, Se Chul Hong, Jin Suk Koo, Hyung Jin Jeong, (2011), "Induction of Apoptosis and Acetylation of Histone H3 and H4 by Arctigenin in the Human Melanoma Cell Line SK-MEL-28", Scientific Research, Vol 2, p. 128 - 132.
21. K Frauenstein, U Sydlik, J Tigges, M Majora, C Wiek, H Hanenberg, J Able, C Esser, E Fritsche, J Krutmann, and T Haarmann-Stemmann, (2013), "Evidence for a novel anti-apoptotic pathway in human keratinocytes involving the aryl hydrocarbon receptor, E2F1, and checkpoint kinase 1",
Cell Death and Diffirentation, Vol 20, p. 1425 - 1434.
22. Katie A. Matatall, Olga A. Agapova, Michael D. Onken, Lori A. Worley, Anne M. Bowcock, and J. William Harbour, (2013), "BAP1 deficiency cause loss of melanocytic cell identity in uveal melanoma", BMC Cancer,
Vol 13, p. 371 - 383.
23. Kenji Matsuno, Mikiko Ito, Kazuya Hori, Fumiyasu Miyashita, Satoshi Suzuki, Noriyuki Kishi, Spyros Artavanis-Tsakonas, and Hideyuki Okano, (2002). "Involvement of a proline-rich motif and RING-H2 finger of Deltex in the regulation of Notch signaling", Development, Vol 129, p. 1049 -
1059.
24. Kunihiko Takeyama, Ricardo C. T. Aguiar, Liqun Gu, Chunyan He, Gordon J. Freeman, Jeffery L. Kutok, Jon C. Aster, and Margaret A. Shipp, (2003), "The BAL-binding Protein BBAP and Related Deltex Family Members Exhibit Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Activity", The Journal of Biological Chemistry, Vol 278 (24), p. 21930 - 21937.
25. Lin H-P, Lin C-Y, Hsiao P-H, Wang H-D, Sheng Jiang S, et al., (2013), "Difference in Protein Expression Profile and Chemotherapy Drugs Response of Different Progression Stages of LNCaP Sublines and Other Human Prostate Cancer Cells", PLoS ONE, Vol 8 (12), doi:
10.1371/journal.pone.0082625
26. Linli Zhou, Kun Yang, Thomas Andl, R, Randall Wickett, Yuhang Zhang, (2015), "Perspective of Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in Melanoma", Journal of Cancer, Vol 6, p. 717 - 726.
27. Marcus Muă hlbauer, Nicole Langenbach, Wilhelm Stolz, Ruediger Hein, M. Landthaler, Reinhard Buettner, and Anja-Katrin Bosserhoff, (1999). "Detection of Melanoma Cells in the Blood of Melanoma Patients by