Chủng vi khuẩn Giá trị Ct Kết quả
O. tsutsugamushi 01 23,57 + O. tsutsugamushi 02 25,31 + Mẫu bệnh dƣơng tính 40 33,48 + Mẫu bệnh dƣơng tính 47 34,17 + Mẫu bệnh dƣơng tính 72 29,52 + Mẫu bệnh dƣơng tính 96 28,95 +
Klebsiella Pneumoniae undetermined -
Acinetobacter baumannii undetermined -
Hình 14. Tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR thử độ đặc hiệu
Chú thích: Đường 1, 2: tín hiệu huỳnh quang của hai chủng O. tsutsugamushi 01 và 02; đường 3,
4, 5, 6: tín hiệu huỳnh quang của các mẫu bệnh dương tính 40, 47, 72, 96.
Nhƣ vậy phản ứng Realtime PCR mà chúng tôi thực hiện đã đƣợc xác định độ đặc hiệu, đảm bảo độ tin cậy để có thể ứng dụng bộ kít này trong chẩn đốn bệnh sốt mị dƣơng tính với vi khuẩn O. tsutsugamushi từ mẫu bệnh phẩm.
3.2.3. Đánh giá độ nhạy của phản ứng Realtime PCR
Để xây dựng đƣờng chuẩn, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng plamid tách dịng mang gen HtrA đã pha lỗng ra các nồng độ tƣơng đƣơng số lƣợng bản sao từ 106 đến 100 plasmid/ml. Sau đó tiến hành phản ứng Realtime PCR trên hệ thống ABI 7500 fast (Applied Biosystems), mỗi độ pha loãng đƣợc lặp lại 3 lần. Đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập từ giá trị logarit lƣợng DNA ban đầu của từng độ pha loãng với giá trị Ct. Hiệu quả khuếch đại đƣợc tính tốn từ độ dốc của đƣờng chuẩn. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 15.
1 2 3 4 5 6
Hình 15. Tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR trên đối chứng dƣơng
Chú thích: 102 – 106: Đường tín hiệu huỳnh quang ghi nhận được tương ứng với nồng độ plasmid/ml.
Kết quả cho thấy đƣờng chuẩn tuyến tính R2 đạt 0,981, Slope -3,33, hiệu quả E là 99%, kết quả lặp lại 3 lần khơng có sự sai khác. Nhƣ vậy phản ứng Realtime PCR trong nghiên cứu này của chúng tơi có kết quả đáng tin cậy, có thể ứng dụng trong các các nghiên cứu tiếp theo để chẩn đốn bệnh sốt mị do vi khuẩn .
106 105 104
103
Hình 16. Đƣờng chuẩn
Kết quả từ bảng 8 và hình 17 cho thấy độ nhạy của Realtime PCR là 100 bản sao/phản ứng.