CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Tách chiết lớp tế bào máu đơn nhân ngoại vi (PBMC)
Quy trình tách chiết lớp tế bào đơn nhân ngoại vi (PBMC) từ các mẫu bệnh nhân đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Đầu tiên, lấy 4ml máu đƣợc thu vào ống có chứa chất chống đơng EDTA. Sau đó, hút 4ml dung dịch Ficoll cho vào ống Falcon 15ml. Rồi, hút toàn bộ 4ml máu ở ống máu cho từ từ và nhẹ nhàng vào ống Falcon 15ml đã chứa 4ml Ficoll. Tiếp theo, ly tâm 1800 rpm trong 20 phút ở nhiệt độ phòng.Hút lớp trên cùng chứa huyết tƣơng ra ống effpendorf 2ml. Và hút hết lớp tiếp theo chứa PBMC ra ống Falcon 15ml. Cuối cùng, ly tâm 1500 rpm trong 15 phút ở nhiệt độ phịng, thu tủa chính là lớp PBMC nếu chƣa sử dụng để tách chiết DNA thì lƣu trữ mẫu ở nhiệt độ -20ºC.
2.3.2. Tách chiết DNA tổng số
Tiến hành tách chiết DNA từ lớp PBMC bằng bộ Kit tách chiết DNA của Qiagen (QIAamp DNA Mini Kit) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.Quy trình tách chiết DNA đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Bƣớc đầu tiên, tiến hành hút 200 µl lysis buffer AL vào ống eppendorf 1,5 ml đã có sẵn 20 µl carrier RNA và 20 µl proteinase K. Sau đó, cho 200 µl bệnh phẩm vào ống eppendorf có chứa hỗn hợp Buffer AL - carrier RNA - proteinase K. Trộn đều bằng cách votex trong 15 giây. Để đảm bảo cho quá trình ly giải đạt hiệu quả tối đa, quá trình votex cần phải đƣợc làm cẩn thận.
Bƣớc tiếp theo,ủ ở nhiệt độ 65°C trong 10 phút. Rồi tiến hành ly tâm nhẹ để đẩy những dung dịch bám ở nắp ống xuống phía dƣới. Bổ sung thêm 200 µl ethanol (96 – 100%), trộn đều bằng votex trong 15 giây. Sau khi trộn, ly tâm nhẹ để đẩy lƣợng dung dịch nhỏ bám ở nắp ống xuống phía dƣới. Cẩn thận chuyển toàn bộ dung dịch ở bƣớc 5 lên cột lọc (đã có ống hứng loại 2 ml ở dƣới). Đóng nắp và ly
tâm ở 8000 vịng/phút trong 1 phút. Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang một ống hứng mới.
Sau đó, mở nắp cột lọc cẩn thận, rửa bằng 500 µl Wash buffer AW1. Đóng nắp và ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang một ống hứng mới. Mở nắp cột lọc cẩn thận, rửa lại bằng 500 µl Wash buffer AW2. Đóng nắp và ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang một ống hứng mới. Đặt cột lọc vào một ống hứng mới, ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 1 phút.
Cuối cùng, đặt cột lọc vào một ống eppendorf 1,5 ml mới và loại bỏ ống hứng có chứa dịch. Mở nắp cột lọc cẩn thận và cho 50 µl Elution buffer AE. Đóng nắp và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1 phút.