Chƣơng trình Chu kỳ Mục đích Nhiệt độ [oC]
Thời gian [Giờ: Phút : Giây]
Biến tính 1 95 00:02:00
Khuếch đại 40 Biến tính 95 00:00:30
Bắt cặp 52 – 60 00:00:30
2.3.6. Nhận định và phân tích kết quả
Hiệu quả của mẫu dị và Taqman probe sẽ đƣợc đánh giá thông qua việc xác định giá trị Ct của phản ứng Realtime RT-PCR. Ct: là chu kỳ ngƣỡng mà máy ghi nhận đƣợc tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng và vƣợt tín hiệu huỳnh quang nền. Sự sai khác về giá trị Ct của cùng 1 mẫu thử nghiệm < 3 chu kỳ là điều kiện lý tƣởng cho việc đánh giá sự ổn định, cũng nhƣ hiệu quả của bộ kit trong các điều kiện bảo quản khác nhau.
Tín hiệu huỳnh quang đƣợc đọc trên kênh FAM nhƣ sau: - Mẫu có Ct ≤ 35 trên kênh FAM đƣợc xem là mẫu dƣơng tính. - Mẫu khơng có tín hiệu trên kênh FAM đƣợc xem là mẫu âm tính.
Trong trƣờng hợp đối chứng dƣơng âm tính, đối chứng âm dƣơng tính thì tiến hành lại tồn bộ q trình thí nghiệm từ bƣớc tạo phản ứng. Các số liệu đƣợc thu thập, phân tích và xử lý theo các phƣơng pháp thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Excel.
2.3.7. Phƣơng pháp xác đi ̣nh độ đặc hiệu phản ứng
Chúng tôi sử dụng 2 chủng vi khuẩn nuôi cấy O. tsutsugamushi, 4 mẫu bệnh
phẩm đã xác định dƣơng tính với O. tsutsugamushi và 3 chủng vi khuẩn gây bệnh khác bao gồm: Klebsiella pneumonia, Acinetobacter baumanii, Escherichia coli.
Sau đó các mẫu chủng vi khuẩn và mẫu bệnh đều đƣợc tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp đã trình bày ở mục 2.3.3 và sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng Realtime PCR. Độ đặc hiệu của phản ứng đƣơ ̣c xác đi ̣nh là tỷ lê ̣ các chủng âm tính với Realtime PCR trên tởng sớ các chủng đƣợc thƣ̉.
2.3.8. Phƣơng pháp xác đi ̣nh độ nhạy của phản ứng
Để xác định độ nhạy của phản ứng Realtime PCR, việc thiết lập đƣờng chuẩn chẩn đoán là rất cần thiết, đặc biệt khi để xác định chính xác số lƣợng bản sao đích ban đầu có trong mẫu thử. Biểu đồ chuẩn trƣớc hết là để đánh giá thao tác pipet của ngƣời làm có đạt hay khơng, và sau đó có thể để xác định số lƣợng tác nhân đích ban đầu có trong mẫu thử. Đƣờng biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngƣỡng với số lƣợng bản sao có trong các mẫu chuẩn đƣợc gọi là đƣờng chuẩn (standard curve).
Có hai thơng số quan trọng trên một đƣờng chuẩn, đầu tiên là hệ số tƣơng quan R2, đánh giá độ chính xác của thao tác pipet hệ số R2 đạt trên hoặc bằng (≥ 0,98) có nghĩa là đƣờng biểu diễn chuẩn đạt độ tuyến tính cao, thao tác pipet của ngƣời thực hiện tƣơng đối chính xác.
Một giá trị khác rất quan trọng là hiệu quả PCR (PCR efficiency – E%) khi Real-time PCR đạt hiệu quả lý tƣởng thì cứ sau mỗi chu kỳ cƣờng độ huỳnh quang trong một ống phản ứng sẽ tăng gấp đơi, nghĩa là nếu độ pha lỗng là 10 lần thì Ct của các độ pha loãng sẽ cách nhau 3,32 chu kỳ (slope là -3,32). Hiệu quả PCR lý tƣởng khi E đạt 100%, tuy nhiên trong thực tế hiệu quả chấp nhận đƣợc trong khoảng 90-100%.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi pha loãng 10 lần các dung di ̣ch có chƣ́a 106 vi khuẩn/ml để có các nồng đ ộ từ 106, 105 đến 101,100 vi khuẩn/ml. Các mẫu này đƣợc tách chiết DNA tổng số theo quy trình của kit QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen) nhƣ đã trình bày trong mục 2.3.3. DNA tổng số sau đó đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng Realtime PCR nhƣ đã trình bày ở các mục trên. Độ nhạy của phản ứng Realtime PCR (giới ha ̣n phát hiê ̣n ) đƣợc xác đi ̣nh là nồng đô ̣ vi khuẩn thấp nhất cho kết quả Realtime PCR dƣơng tính.
2.3.9. Đạo đức nghiên cứu
- Nghiên cứu đƣợc sự đồng chấp thuận bởi hội đồng đạo đức của bệnh viện. - Đối tƣợng nghiên cứu đƣợc giải thích về mục đích và nội dung của nghiên
cứu trƣớc khi tiến hành nghiên cứu và chỉ tiến hành khi có sự chấp nhận hợp tác tham gia của đối tƣợng nghiên cứu.
- Mọi thông tin cá nhân về đối tƣợng nghiên cứu đều đƣợc giữ kín. Các số liệu, thông tin thu thập đƣợc chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu, khơng phục vụ cho mục đích nào khác.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Quy trình tối ƣu phản ứng Realtime – PCR
3.1.1. Thiết kế mồi
Các trình tự trình tự của gen kháng nguyên 47 kD đƣợc bảo tồn trong 5 chủng của O. tsutsugamushi bao gồm: Karp(mã số L31934.1), Kato(mã số HM595493.1),
Gilliam(mã số L31933.1), Boryong(mã số NC_009488.1) và TH1817(mã số
HM156064.1) đƣợc tham khảo từ Ngân hàng dữ liệu NCBI ( GenBank). Tiếp theo, tiến hành sắp gióng cột các trình tự tải về bằng phần mềm ClustalX. Sử dụng chƣơng trình BioEdit để chọn ra các vùng bảo tồn đặc trƣng cho O. tsutsugamushi và tiến hành thiết kế mồi và mẫu dị.
Sau đó, các mồi và mẫu dò cho phù hợp với các tiêu chuẩn (kích thƣớc, % GC, Tm, các cấu trúc thứ cấp) đƣợc kiểm tra và chỉnh sửa bằng phần mềm trực tuyến OligoAnalyzer (IDT) [ 54, 55]. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ trong Bảng 4 .
Bảng 4: Các thơng số đặc tính của mồi và mẫu dị
Đặc tính Kích thƣớc (bp) % GC Tm (oC)
Mồi xuôi 26 30,8 53,5
Mồi ngƣợc 26 32,7 53,1 – 54,9
Probe 25 44 58,5
Bảng 5: Năng lƣợng tự do ΔG của cấu trúc thứ cấp của mồi (kcal/mol) Hairpin loop Self dimer Hetero dimer
ΔG (kcal/mol) ΔG (kcal/mol) ΔG (kcal/mol)
Mồi xuôi 0.85 - 3,53 -8,29 (F-R)
Mồi ngƣợc 2,14 -6,14 -10,38 (R-P)
Probe 0,56 -6,34 -4,99 (F-P)
Dựa trên kết quả khảo sát đặc tính của mồi (Bảng 4 và 5), chúng tơi nhận thấy: Về mặt kích thƣớc, cả hệ mồi và mẫu dò đều đạt yêu cầu về chiều dài tốt nhất (18 – 30bp). Đối với thành phần %GC, các mồi trên có %GC nằm trong tỉ lệ yêu cầu.
Nhiệt độ lai của mồi và mẫu dò thoả mãn điều kiện thiết kế. Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn mồi từ 5 – 10oC (vì ở giai đoạn 60oC là nhiệt độ bắt cặp tối ƣu của Taqman probe, mẫu dò sẽ bắt cặp vào sợi đích trƣớc, rồi mồi mới bắt cặp).
Cấu trúc thứ cấp bao gồm: hairpin loop (cấu trúc kẹp tóc), self dimer (oligonucleotide tự bắt cặp với chính nó), hetero dimer (sự bắt cặp giữa hai oligonucleotide khác nhau). Trong phản ứng PCR, nếu cấu trúc bậc hai này càng bền vững bao nhiêu thì hiệu quả nhân bản càng giảm đi bấy nhiêu. Độ bền vững của các cấu trúc thứ cấp đƣợc đo bằng chỉ số năng lƣợng tự do (∆G, kcal/mole), chỉ số này phải lớn hơn -9kcal (theo hãng IDT) vì ∆G càng lớn bao nhiêu thì cấu trúc càng kém bền bấy nhiêu, do đó sẽ khơng ảnh hƣởng đến hoạt động của PCR. Kết quả khảo sát trên phần mềm trực tuyến IDT oligo analyzer cho thấy, đa số cấu trúc thứ cấp của hệ mồi và mẫu dị đều có ∆G > - 9 kcal. Tuy nhiên có 1 cấu trúc có ∆G < -9 kcal/mol nhƣng độ chênh lệch này không lớn lắm so với tiêu chuẩn cho phép, với nhiệt độ lai cao thì cấu trúc này dễ dàng bị phá vỡ. Thông qua thực nghiệm chúng tôi sẽ khảo sát kỹ hơn mức độ ảnh hƣởng của yếu tố này.
Sau đó, chúng tơi sử dụng cơng cụ Blast trên NCBI để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò đối với các trình tự đích đã sử dụng. Kết quả khảo sát trên Blast
cho thấy mồi xi, mồi ngƣợc, mẫu dị đƣợc thiết kế có tỷ lệ bắt cặp rất cao với trình tự đích (hình 4, 5, 6). Sự tƣơng đồng với các loài khác là rất thấp, không đáng tin cậy do giá trị E-value đối với các trình tự khác đều rất cao. Giá trị E-value là một thông số thể hiện mức độ tin cậy về sự tƣơng đồng giữa hai trình tự. Giá trị này càng nhỏ hoặc bằng 0 thì sự tƣơng đồng giữa các trình tự càng có ý nghĩa. Điều này chứng tỏ hệ mồi và mẫu dò do chúng tơi thiết kế có độ chun biệt cao.
Hình 4. Kết quả so sánh cho mồi xi với các trình tự đích
Hình 6. Kết quả so sánh probe với các trình tự đích
3.1.2. Tối ƣu nhiệt độ gắn Taqman probe
Trong nghiên cứu này, nhiệt độ bắt cặp của Taqman probe đƣợc tối ƣu hóa ở các điều kiện 52oC,55oC, 58oC và 60oC. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 7, hình 8 và hình 9, 10.
Hình 8. Tín hiệu khuếch đại Realtime PCR ở 55oC
Hình 10. Tín hiệu khuếch đại Realtime PCR ở 60oC
Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 60oC thì đƣờng khuếch đại huỳnh quang cho tín hiệu cao hơn và đƣờng curve đạt yêu cầu tốt hơn nên chúng tôi chọn nhiệt độ 60oC để tiến hành tối ƣu các điều kiện tiếp theo.
3.1.3. Kết quả tối ƣu nồng độ magie của phản ứng Realtime PCR
Magie là thành phần quan trọng giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng Realtime – PCR. Theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất chúng tôi tiến hành tối ƣu nồng độ MgSO4 ở nồng độ cuối cùng là 4 mM, 5 mM và 6 mM. Kết quả thể hiện ở hình 11.
Hình 11: Đƣờng khuếch đại Realtime-PCR ở nồng độ Mg2+ khác nhau
Kết quả cho thấy ở cùng một nồng độ DNA ban đầu, đƣờng biểu diễn huỳnh quang ở nồng độ MgS04 5 mM xuất hiện sớm hơn khoảng 2 chu kỳ so với 2 nồng độ MgSO4 4 mM và 6 mM (bảng 6). Do vậy, chúng tôi sử dụng nồng độ MgSO4 ở mức 5mM để tiến hành phản ứng.
Bảng 6 .Chu kỳ ngƣỡng của Realtime-PCR ở nồng độ Mg2+ khác nhau
Nồng độ MgS04 Ct
4 mM 30,7
5 mM 27,6
3.2. Xây dựng quy trình chẩn đốn O. tsutsugamushi bằng Realtime PCR
3.2.1. Tách chiết DNA
O. tsutsugamushi là vi khuẩn kí sinh nội bào bắt buộc, lƣu hành trong máu bệnh nhân, phát triển, nhân lên và tồn tại trong các tế bào máu đơn nhân ngoại vi. Vì vậy, để tăng khả năng thu đƣợc DNA của O.tsutsugamushi, chúng tôi đã tiến
hành tách chiết lớp tế bào máu đơn nhân ngoại vi trƣớc bằng dung dịch Ficoll. Kết quả đã thu đƣợc hầu hết lƣợng tế bào máu đơn nhân ngoại vi phục vụ cho quá trình tách chiết DNA tiếp theo.
Chúng tôi tiến hành tách chiết bằng bộ Kit QIAamp DNA Mini Kit của Qiagen. Các mẫu DNA sau khi tách chiết đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng thiết bị máy đo quang phổ. Đo độ hấp thu quang phổ của DNA ở bƣớc sóng 260nm và của protein ở bƣớc sóng 280nm. Nồng độ của DNA đƣợc tính bằng độ hấp thu quang phổ ở bƣớc sóng 260nm, độ tinh sạch đƣợc đánh giá bằng tỷ số hấp thu OD260/OD280. DNA thu đƣợc có tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng 1,8 - 2,0 đƣợc coi là khá tinh sạch, không lẫn protein và các tạp chất khác. DNA tổng số này đảm bảo để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Ứng dụng phản ứng Realtime PCR chẩn đoán O. tsutsugamushi
Dựa trên quy trình tối ƣu trên, chúng tôi đã tiến hành xét nghiệm Realtime PCR trên tổng số 156 bệnh nhân ( trong đó có 81 bệnh nhân nam chiếm tỉ lệ 51,9% và 75 bệnh nhân nữ chiếm tỉ lệ 48,1%) đƣợc nghi nghờ có nhiễm vi khuẩn O. tsutsugamushi ( Hình 12). Kết quả thu đƣợc với số mẫu dƣơng tính với gen HtrA là
78 mẫu, chiếm tỉ lệ 50 % tổng số bệnh nhân đƣợc xét nghiệm. Trong đó có 41 bệnh nhân nam chiếm tỉ lệ 52.7% và 37 bệnh nhân nữ chiếm tỉ lệ 47.3% có kết quả dƣơng tính với O. tsutsugamushi. Xét riêng trong mỗi nhóm thì tỉ lệ mắc bệnh ở nam và nữ khá cao (Hình 13).
Hình 12. Kết quả Realtime PCR trên một số mẫu bệnh nhân đƣợc xét nghiệm
Chú thích: Dương tính: tín hiệu huỳnh quang của mẫu chứng dương sử dụng DNA tách từ chủng
O. tsutsugamushi; Mẫu 1,3: tín hiệu huỳnh quang của mẫu bệnh nhân dương tính với O. tsutsugamushi, Mẫu 2.4: tín hiệu huỳnh quang của mẫu bệnh nhân âm tính với O. tsutsugamushi.NTC: Mẫu chứng âm.
Hình 13. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm O.tsutsugamushi bằng Real time - PCR
Chú thích: 51,9%: Tỉ lệ bệnh nhân nam trên tổng số bệnh nhân đưa vào nghiên cứu. 48,1%:
Tỉ lệ bệnh nhân nữa trên tổng số bệnh nhân đưa vào nghiên cứu. 52,7%: Tỉ lệ bệnh nhân nam trên tổng số bệnh nhân dương tính với O. tsutsugamushi. 47,3%: Tỉ lệ bệnh nhân nữ trên tổng số bệnh nhân dương tính với O. tsutsugamushi.
3.2.3.Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR
Để xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR dùng trong chẩn đốn O.
tsutsugamushi, chúng tơi tiến hành thí nghiệm sử dụng đối chứng dƣơng là mẫu
DNA đƣợc tách chiết từ chủng vi khuẩn O. tsutsugamushi, đối chứng âm là các mẫu DNA tổng số đƣợc tách chiết từ 3 chủng vi khuẩn gây bệnh khác bao gồm:
Klebsiella pneumonia, Acinetobacter baumanii, Escherichia Coli. DNA tổng số đã
đƣợc đƣa vào hỗn hợp cho phản ứng Realtime PCR chứa các primers và probe đặc trƣng cho O.tsutsugamushi. Qúa trình này nhằm mục đích kiểm tra khả năng bắt cặp, khuếch đại và phát tín hiệu huỳnh quang của phản ứng. Kết quả cho thấy kết quả Realtime PCR chỉ cho kết quả dƣơng tính mẫu DNA của chủng vi khuẩn ni cấy và mẫu bệnh phẩm dƣơng tính O. tsutsugamushi, không xảy ra phản ứng chéo với các vi khuẩn gây bệnh khác. Nhƣ vậy độ đặc hiệu trong nghiên cứu này của chúng tôi đạt 100%. Kết quả độ đặc hiệu đƣợc thể hiện trong bảng 7 và hình 14.
51,9 52,7 48,1 47,3 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 Tổng số Dƣơng tính T ỷ lệ % Nam Nữ
Bảng 7. Kết quả độ đặc hiệu của phản ứng Realtime – PCR
Chủng vi khuẩn Giá trị Ct Kết quả
O. tsutsugamushi 01 23,57 + O. tsutsugamushi 02 25,31 + Mẫu bệnh dƣơng tính 40 33,48 + Mẫu bệnh dƣơng tính 47 34,17 + Mẫu bệnh dƣơng tính 72 29,52 + Mẫu bệnh dƣơng tính 96 28,95 +
Klebsiella Pneumoniae undetermined -
Acinetobacter baumannii undetermined -
Hình 14. Tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR thử độ đặc hiệu
Chú thích: Đường 1, 2: tín hiệu huỳnh quang của hai chủng O. tsutsugamushi 01 và 02; đường 3,
4, 5, 6: tín hiệu huỳnh quang của các mẫu bệnh dương tính 40, 47, 72, 96.
Nhƣ vậy phản ứng Realtime PCR mà chúng tôi thực hiện đã đƣợc xác định độ đặc hiệu, đảm bảo độ tin cậy để có thể ứng dụng bộ kít này trong chẩn đốn bệnh sốt mị dƣơng tính với vi khuẩn O. tsutsugamushi từ mẫu bệnh phẩm.
3.2.3. Đánh giá độ nhạy của phản ứng Realtime PCR
Để xây dựng đƣờng chuẩn, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng plamid tách dịng mang gen HtrA đã pha lỗng ra các nồng độ tƣơng đƣơng số lƣợng bản sao từ 106 đến 100 plasmid/ml. Sau đó tiến hành phản ứng Realtime PCR trên hệ thống ABI 7500 fast (Applied Biosystems), mỗi độ pha loãng đƣợc lặp lại 3 lần. Đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập từ giá trị logarit lƣợng DNA ban đầu của từng độ pha loãng với giá trị Ct. Hiệu quả khuếch đại đƣợc tính tốn từ độ dốc của đƣờng chuẩn. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 15.
1 2 3 4 5 6
Hình 15. Tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR trên đối chứng dƣơng
Chú thích: 102 – 106: Đường tín hiệu huỳnh quang ghi nhận được tương ứng với nồng độ plasmid/ml.
Kết quả cho thấy đƣờng chuẩn tuyến tính R2 đạt 0,981, Slope -3,33, hiệu quả E là 99%, kết quả lặp lại 3 lần khơng có sự sai khác. Nhƣ vậy phản ứng Realtime PCR trong nghiên cứu này của chúng tơi có kết quả đáng tin cậy, có thể ứng dụng trong các các nghiên cứu tiếp theo để chẩn đốn bệnh sốt mị do vi khuẩn .
106 105 104
103
Hình 16. Đƣờng chuẩn
Kết quả từ bảng 8 và hình 17 cho thấy độ nhạy của Realtime PCR là 100 bản sao/phản ứng.
Bảng 8. Kết quả thử độ nhạy của phản ứng Realtime PCR
Hình 17. Tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR cho độ nhạy
Chú thích: 102 – 106: Đường tín hiệu huỳnh quang ghi nhận được tương ứng với bản sao/ml.