Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 60oC thì đƣờng khuếch đại huỳnh quang cho tín hiệu cao hơn và đƣờng curve đạt yêu cầu tốt hơn nên chúng tôi chọn nhiệt độ 60oC để tiến hành tối ƣu các điều kiện tiếp theo.
3.1.3. Kết quả tối ƣu nồng độ magie của phản ứng Realtime PCR
Magie là thành phần quan trọng giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng Realtime – PCR. Theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất chúng tôi tiến hành tối ƣu nồng độ MgSO4 ở nồng độ cuối cùng là 4 mM, 5 mM và 6 mM. Kết quả thể hiện ở hình 11.
Hình 11: Đƣờng khuếch đại Realtime-PCR ở nồng độ Mg2+ khác nhau
Kết quả cho thấy ở cùng một nồng độ DNA ban đầu, đƣờng biểu diễn huỳnh quang ở nồng độ MgS04 5 mM xuất hiện sớm hơn khoảng 2 chu kỳ so với 2 nồng độ MgSO4 4 mM và 6 mM (bảng 6). Do vậy, chúng tôi sử dụng nồng độ MgSO4 ở mức 5mM để tiến hành phản ứng.
Bảng 6 .Chu kỳ ngƣỡng của Realtime-PCR ở nồng độ Mg2+ khác nhau
Nồng độ MgS04 Ct
4 mM 30,7
5 mM 27,6
3.2. Xây dựng quy trình chẩn đốn O. tsutsugamushi bằng Realtime PCR
3.2.1. Tách chiết DNA
O. tsutsugamushi là vi khuẩn kí sinh nội bào bắt buộc, lƣu hành trong máu bệnh nhân, phát triển, nhân lên và tồn tại trong các tế bào máu đơn nhân ngoại vi. Vì vậy, để tăng khả năng thu đƣợc DNA của O.tsutsugamushi, chúng tôi đã tiến
hành tách chiết lớp tế bào máu đơn nhân ngoại vi trƣớc bằng dung dịch Ficoll. Kết quả đã thu đƣợc hầu hết lƣợng tế bào máu đơn nhân ngoại vi phục vụ cho quá trình tách chiết DNA tiếp theo.
Chúng tôi tiến hành tách chiết bằng bộ Kit QIAamp DNA Mini Kit của Qiagen. Các mẫu DNA sau khi tách chiết đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng thiết bị máy đo quang phổ. Đo độ hấp thu quang phổ của DNA ở bƣớc sóng 260nm và của protein ở bƣớc sóng 280nm. Nồng độ của DNA đƣợc tính bằng độ hấp thu quang phổ ở bƣớc sóng 260nm, độ tinh sạch đƣợc đánh giá bằng tỷ số hấp thu OD260/OD280. DNA thu đƣợc có tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng 1,8 - 2,0 đƣợc coi là khá tinh sạch, không lẫn protein và các tạp chất khác. DNA tổng số này đảm bảo để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Ứng dụng phản ứng Realtime PCR chẩn đoán O. tsutsugamushi
Dựa trên quy trình tối ƣu trên, chúng tôi đã tiến hành xét nghiệm Realtime PCR trên tổng số 156 bệnh nhân ( trong đó có 81 bệnh nhân nam chiếm tỉ lệ 51,9% và 75 bệnh nhân nữ chiếm tỉ lệ 48,1%) đƣợc nghi nghờ có nhiễm vi khuẩn O. tsutsugamushi ( Hình 12). Kết quả thu đƣợc với số mẫu dƣơng tính với gen HtrA là
78 mẫu, chiếm tỉ lệ 50 % tổng số bệnh nhân đƣợc xét nghiệm. Trong đó có 41 bệnh nhân nam chiếm tỉ lệ 52.7% và 37 bệnh nhân nữ chiếm tỉ lệ 47.3% có kết quả dƣơng tính với O. tsutsugamushi. Xét riêng trong mỗi nhóm thì tỉ lệ mắc bệnh ở nam và nữ khá cao (Hình 13).
Hình 12. Kết quả Realtime PCR trên một số mẫu bệnh nhân đƣợc xét nghiệm
Chú thích: Dương tính: tín hiệu huỳnh quang của mẫu chứng dương sử dụng DNA tách từ chủng
O. tsutsugamushi; Mẫu 1,3: tín hiệu huỳnh quang của mẫu bệnh nhân dương tính với O. tsutsugamushi, Mẫu 2.4: tín hiệu huỳnh quang của mẫu bệnh nhân âm tính với O. tsutsugamushi.NTC: Mẫu chứng âm.
Hình 13. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm O.tsutsugamushi bằng Real time - PCR
Chú thích: 51,9%: Tỉ lệ bệnh nhân nam trên tổng số bệnh nhân đưa vào nghiên cứu. 48,1%:
Tỉ lệ bệnh nhân nữa trên tổng số bệnh nhân đưa vào nghiên cứu. 52,7%: Tỉ lệ bệnh nhân nam trên tổng số bệnh nhân dương tính với O. tsutsugamushi. 47,3%: Tỉ lệ bệnh nhân nữ trên tổng số bệnh nhân dương tính với O. tsutsugamushi.
3.2.3.Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR
Để xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR dùng trong chẩn đốn O.
tsutsugamushi, chúng tơi tiến hành thí nghiệm sử dụng đối chứng dƣơng là mẫu
DNA đƣợc tách chiết từ chủng vi khuẩn O. tsutsugamushi, đối chứng âm là các mẫu DNA tổng số đƣợc tách chiết từ 3 chủng vi khuẩn gây bệnh khác bao gồm:
Klebsiella pneumonia, Acinetobacter baumanii, Escherichia Coli. DNA tổng số đã
đƣợc đƣa vào hỗn hợp cho phản ứng Realtime PCR chứa các primers và probe đặc trƣng cho O.tsutsugamushi. Qúa trình này nhằm mục đích kiểm tra khả năng bắt cặp, khuếch đại và phát tín hiệu huỳnh quang của phản ứng. Kết quả cho thấy kết quả Realtime PCR chỉ cho kết quả dƣơng tính mẫu DNA của chủng vi khuẩn ni cấy và mẫu bệnh phẩm dƣơng tính O. tsutsugamushi, không xảy ra phản ứng chéo với các vi khuẩn gây bệnh khác. Nhƣ vậy độ đặc hiệu trong nghiên cứu này của chúng tôi đạt 100%. Kết quả độ đặc hiệu đƣợc thể hiện trong bảng 7 và hình 14.
51,9 52,7 48,1 47,3 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 Tổng số Dƣơng tính T ỷ lệ % Nam Nữ
Bảng 7. Kết quả độ đặc hiệu của phản ứng Realtime – PCR
Chủng vi khuẩn Giá trị Ct Kết quả
O. tsutsugamushi 01 23,57 + O. tsutsugamushi 02 25,31 + Mẫu bệnh dƣơng tính 40 33,48 + Mẫu bệnh dƣơng tính 47 34,17 + Mẫu bệnh dƣơng tính 72 29,52 + Mẫu bệnh dƣơng tính 96 28,95 +
Klebsiella Pneumoniae undetermined -
Acinetobacter baumannii undetermined -
Hình 14. Tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR thử độ đặc hiệu
Chú thích: Đường 1, 2: tín hiệu huỳnh quang của hai chủng O. tsutsugamushi 01 và 02; đường 3,
4, 5, 6: tín hiệu huỳnh quang của các mẫu bệnh dương tính 40, 47, 72, 96.
Nhƣ vậy phản ứng Realtime PCR mà chúng tôi thực hiện đã đƣợc xác định độ đặc hiệu, đảm bảo độ tin cậy để có thể ứng dụng bộ kít này trong chẩn đốn bệnh sốt mị dƣơng tính với vi khuẩn O. tsutsugamushi từ mẫu bệnh phẩm.
3.2.3. Đánh giá độ nhạy của phản ứng Realtime PCR
Để xây dựng đƣờng chuẩn, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng plamid tách dịng mang gen HtrA đã pha lỗng ra các nồng độ tƣơng đƣơng số lƣợng bản sao từ 106 đến 100 plasmid/ml. Sau đó tiến hành phản ứng Realtime PCR trên hệ thống ABI 7500 fast (Applied Biosystems), mỗi độ pha loãng đƣợc lặp lại 3 lần. Đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập từ giá trị logarit lƣợng DNA ban đầu của từng độ pha loãng với giá trị Ct. Hiệu quả khuếch đại đƣợc tính tốn từ độ dốc của đƣờng chuẩn. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 15.
1 2 3 4 5 6
Hình 15. Tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR trên đối chứng dƣơng
Chú thích: 102 – 106: Đường tín hiệu huỳnh quang ghi nhận được tương ứng với nồng độ plasmid/ml.
Kết quả cho thấy đƣờng chuẩn tuyến tính R2 đạt 0,981, Slope -3,33, hiệu quả E là 99%, kết quả lặp lại 3 lần khơng có sự sai khác. Nhƣ vậy phản ứng Realtime PCR trong nghiên cứu này của chúng tơi có kết quả đáng tin cậy, có thể ứng dụng trong các các nghiên cứu tiếp theo để chẩn đốn bệnh sốt mị do vi khuẩn .
106 105 104
103
Hình 16. Đƣờng chuẩn
Kết quả từ bảng 8 và hình 17 cho thấy độ nhạy của Realtime PCR là 100 bản sao/phản ứng.
Bảng 8. Kết quả thử độ nhạy của phản ứng Realtime PCR
Hình 17. Tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR cho độ nhạy
Chú thích: 102 – 106: Đường tín hiệu huỳnh quang ghi nhận được tương ứng với bản sao/ml.
Nhƣ vậy, giới hạn phát hiện vi khuẩn gây sốt mò O. tsutsugamushi trong phản ứng Realtime PCR là 100 bản sao/ ml.
Số bản sao vi khuẩn/phản ứng Giá trị Ct Kết quả
106 27,36 + 105 29.20 + 104 31,15 + 103 33,40 + 102 35,25 + 101 undetermined - 100 undetermined - 106 105 104 103 102
3.3. Một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân nghi mắc bệnh sốt mò
Tất cả 156 bệnh nhân trong nghiên cứu đều là bệnh nhân nội trú, nhập viện vì có triệu chứng sốt cấp tính. Nhiệt độ ≥ 39oC ở 58 bệnh nhân, chiếm tỉ lệ 37,2% trên tổng số bệnh nhân nghiên cứu. Nhiệt độ sốt cao nhất đo đƣợc là 40oC. Một số triệu chứng và tính chất khởi phát thƣờng gặp đƣợc thu thập ở bệnh nhân nghi ngờ nhiễm
O. tsutsugamushi đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 09. Biểu hiện cơ năng và triệu chứng khởi phát của bệnh nhân nghiên cứu
Biểu hiện của bệnh nhân (N = 156) Số ngƣời Tỉ lệ (%) Khởi phát Sốt đột ngột 108 69.2 Sốt tăng dần 48 30.8 Tính chất sốt Sốt liên tục 68 43.6 Sốt từng cơn 88 56.4 Đau đầu 109 69.9 Buồn nôn 33 21.2 Đau cơ 90 57.7 Phát ban 37 23.7 Có vết đốt 55 35.3
3.4. Kết quả khảo sát các yếu tố liên quan đến nhiễm O. tsutsugamushi ở các bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Bạch Mai năm 2016 bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Bạch Mai năm 2016
3.4.1. Tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi theo tuổi
Theo phân tích số bệnh nhân có kết quả dƣơng tính, O. tsutsugamushi chủ yếu phân bố ở độ tuổi trung niên trở lên (≥ 40 tuổi). Trong đó, số bệnh nhân lớn hơn 50 tuổi chiếm tỉ lệ cao nhất khoảng 50 % tổng số bệnh nhân có kết quả dƣơng tính. Tuổi của bệnh nhân cao tuổi nhất ghi nhận đƣợc có nhiễm O. tsutsugamushi là 88
tuổi. Số bệnh nhân mắc O. tsutsugamushi ở độ tuổi học sinh, sinh viên chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ (6,4% so với tổng số bệnh nhân dƣơng tính).
Quan sát từ biểu đồ, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ mặc nhiễm O. tsutsugamushi ở mỗi nhóm tuổi đều chiếm khoảng 50 %, nghĩa là cứ 100 bệnh nhân đƣợc nghi ngờ nhiễm O. tsutsugamushi thì sẽ có 50 ngƣời có kết quả dƣơng tính. Tỉ lệ nhiễm bệnh cũng tăng dần theo số tuổi, cao nhất ở nhóm tuổi 51 – 60 tuổi. Tuổi của bệnh nhân mắc bệnh sốt mò trong nghiên cứu của chúng tôi là 49,94 ± 16,36( giới hạn 16 – 88 tuổi). Kết quả này tƣơng đồng với kết quả trong nghiên cứu của tác giả Phạm Thanh Thủy là 45,85 ± 17,56 [18], tuy nhiên cao hơn so với kết quả nghiên cứu của tác giả Lê Đăng Hà và Cao Văn Viên 41,18 ± 17,73[13], cao hơn Đỗ Văn Thành 36,59 ± 16,05 [17]. Lý do có thể giải thích là bệnh nhân nhập viện vào khoa Truyền Nhiễm của bệnh viện Bạch Mai là bệnh nhân ngƣời lớn.
Trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy bệnh nhân phân bố ở hầu hết các lứa tuổi( hình 18). Lứa tuổi mắc bệnh nhiều nhất là từ 51 – 60 tuổi chiếm 28,6%, tiếp theo là nhóm tuổi ≥ 60 tuổi, chiếm 22,6%. Và nhóm bệnh ≤ 20 tuổi chiếm tỉ lệ thấp nhất 6,4%. Do bệnh viện của chúng tôi chủ yếu dành cho bệnh nhân ngƣời lớn và khơng có nhiều bệnh nhi đƣợc điều trị tại bệnh viện.
Hình 18. Sự phân bố nhiễm bệnh sốt mị theo nhóm tuổi
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ≤ 20 21 – 30 31 – 40 41 – 50 51 – 60 ≥ 60 T ỉ l ệ % Số ngƣ ời
3.4.2. Tỉ lệ nhiễm O. tsutsugamushi theo giới tính
Dựa theo kết quả thống kê từ số bệnh nhân dƣơng tính, chúng tơi nhận thấy tỉ lệ nhiễm O.tsutsugamushi xuất hiện tƣơng đối đều ở cả nam và nữ. Số bệnh nhân nữ nhiễm bệnh là 37 ngƣời, chiếm 47 % tổng số bệnh nhân dƣơng tính (78 ngƣời), số bệnh nhân nam là 41 ngƣời, chiếm 53%. So với số ngƣời đã đƣợc xét nghiệm, số bệnh nhân nam đều chiếm số lƣợng nhiều hơn bệnh nhân nữ, tuy nhiên tỉ lệ này không chênh lệch đáng kể. Tỉ lệ này tƣơng đƣơng với kết quả nghiên cứu của Phạm Thanh Thủy ( nam 50,6%, nữ 49,4%) [18], Đỗ Văn Thành ( nam 49,0%, nữ 51,0%) [17]. Nhƣng khác biệt so với Lê Văn An ( nam 61,0%, nữ 39,0%) [1] và Nguyễn Trọng Chính ( nam 60,9%, nữ 39,1%) [5]. Theo chúng tôi, tỉ lệ nam : nữ phản ánh sự khác biệt trong yếu tố phơi nhiễm cũng nhƣ quần thể bệnh nhân đƣợc điều trị tại cơ sở nghiên cứu. Đối tƣợng phục vụ tại bệnh viện Bạch Mai( nghiên cứu hiện tại của chúng tôi và Phạm Thanh Thủy và Đỗ Văn Thành) là quần thể bình thƣờng ngồi cộng đồng, trong khi của viện 108 ( Nguyễn Trọng Chính) bao gồm cả ngƣời dân và quân nhân, mà tỉ lệ nam quân nhân cao hơn nữa quân nhân do đó tỉ lệ nam cao hơn nữ. Tỉ lệ nam cao hơn nữ tại Thừa Thiên Huế của Lê Văn An [1] có thể phản ánh đặc điểm phơi nhiễm khác biệt tại địa phƣơng đó.
Hình 19. Tỉ lệ nhiễm bệnh sốt mị ở nam và nữ
53%
47% Nam
3.4.3. Phân bố nhiễm bệnh theo nhóm nghề nghiệp
Bệnh nhân có kết quả dƣơng tính với O. tsutsugamushicó phân bố rộng ở
nhiều nhóm ngành nghề khác nhau. Số bệnh nhân là công nhân và đang ở tuổi học sinh, sinh viên chiếm tỉ lệ nhỏ nhất (< 10%). Nhóm bệnh nhân là nơng dân có tỉ lệ nhiễm cao nhất, vƣợt trội hẳn so với các nhóm ngành nghề cịn lại, chiếm đến 42.3% trên tổng số ngƣời bị nhiễm. Các nhóm ngành nghề khác chiếm tỉ lệ nhiễm tƣơng đối khoảng từ 10% - 20%. Nghiên cứu của chúng tôi tƣơng tự với nghiên cứu của Phạm Thanh Thủy [18] với 56,2% làm ruộng, Nguyễn Trọng Chính [8] và Đỗ Văn Thành [17] cũng cho kết quả tƣơng tự. Nhƣ vậy, chúng ta có thể khẳng định một lần nữa rằng, những ngƣời nơng dân có nguy cơ phơi nhiễm với ấu trùng mò cao nhất và là đối tƣợng chính bị bệnh.
Bảng 10. Phân bố nhiễm bệnh sốt mò theo nghề nghiệp
Nghề nghiệp Số ngƣời xét nghiệm Số bệnh nhân Tỉ lệ nhiễm ( %)
Học sinh, sinh viên 08 05 6.4
Nông dân 68 33 42.3 Công nhân 03 01 1.3 Nhân viên 38 16 20.5 Ở nhà (nghỉ hƣu, nội trợ) 24 14 18.0 Ngành nghề khác 15 09 11.5 Tổng số 156 78 100
Hình 20. Sự phân bố nhiễm bệnh sốt mị theo nhóm ngành nghề
3.4.4. Phân bố nhiễm bệnh theo vùng miền, địa phƣơng
Bệnh nhân sốt mò cƣ trú ở nhiều vùng khác nhau, trong đó nơng thơn là nơi có nhiều bệnh nhân dƣơng tính với O. tsutsugamushi nhất, sau đó là ở các vùng là thị xã/thị trấn, thành phố. Tuy nhiên khả năng mắc bệnh của các bệnh nhân cƣ trú ở thành phố và thị trấn lại cao hơn so với ở nông thôn (khả năng mắc bệnh cao hơn 50%, trong khi ở nơng thơn chỉ có 44%). Các bệnh nhân sống trong thành phố có thể đã phơi nhiễm với sốt mò khi tới các vùng dịch tễ hoặc ngay tại nơi cƣ trú.
Bảng 11. Phân bố nhiễm bệnh sốt mò theo vùng miền, địa phƣơng
Vùng Số ngƣời xét nghiệm Số ngƣời nhiễm bệnh Tỉ lệ nhiễm (%)
Thành phố 43 25 32.1 Thị trấn 38 20 25.6 Nông thôn 75 33 42.3 Tổng số 156 78 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Học sinh, sinh viên
Nông dân Công nhân Nhân viên Nghỉ
hƣu, nội trợ Ngành nghề khác T ỉ l ệ % Số ngƣ ời
Hình 21. Sự phân bố bệnh sốt mị theo vùng
Sự phân bố của bệnh sốt mị đƣợc chúng tơi thống kê theo từng miền địa hình: miền núi, trung du, đồng bằng và miền biển. Kết quả phân bố phản ánh bệnh chủ yếu xuất hiện ở miền đồng bằng, số ít ở trung du và giảm hẳn ở miền núi. Riêng miền biển có số bệnh nhân xét nghiệm rất nhỏ nên chƣa phản ánh đƣợc sự ảnh hƣởng. Tuy nhiên sự phân bố này hợp lý với đặc tính sinh trƣởng của O. tsutsugamushi. Bởi đồng bằng là nơi có đơng dân cƣ, động vật có khả năng cao tiếp
xúc với con ngƣời hằng ngày nhƣ chó mèo, chuột… làm tăng cơ hội nhiễm bệnh cho ngƣời, và tăng sự lây lan giữa ngƣời sang ngƣời. Ở các miền khác thì tỉ lệ nhiễm giảm xuống do hạn chế về tiếp xúc nguồn bệnh và khơng phải là nơi thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của O. tsutsugamushi. Nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Vũ Hồng Chiến và Nguyễn Thị Kim Chính trong tổng số 73 bệnh nhân nghiên cứu bệnh nhân nhiễm sốt mò chủ yếu là vùng đồng bằng, thành thị ( bao gồm chủ yếu là Hà Nội: 16,3% và các tỉnh lân cận: Hƣng Yên