1.3 .Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng
1.3.2. Các loại chỉ thị phân tử
- Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Loại chỉ thị này đƣợc tạo ra bằng cách nhân lên một cách chọn lọc DNA hệ gen đã đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn bằng máy PCR. Sản phẩm tạo ra sẽ cho biết sự đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn của phân tử DNA.
Chỉ thị AFLP đƣợc sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tử liên kết gen. Kỹ thuật tạo ra loại chỉ thị này đƣợc gọi là nhân bội chọn lọc những đoạn cắt giới hạn (Selective Restriction Fragment Amplification - SRFA)
Sử dụng phƣơng pháp này có thể tạo ra một bộ tập hợp những đoạn cắt giới hạn nhờ PCR mà khơng cần biết trình tự của chúng, cho phép nhân đặc hiệu một số lƣợng lớn những mảnh cắt giới hạn. Mỗi bộ gồm tập hợp một số lƣợng lớn những mảnh cắt DNA có thể phân tích đồng thời phụ thuộc vào độ phân giải của hệ thống phát hiện.
Phân tích sản phẩm bằng điện di trên gel polyacrylamide, mỗi mẫu thí nghiệm sẽ cho từ 50-100 băng DNA khác nhau nhờ sử dụng đồng vị phóng xạ hoặc nhuộm bạc. Đây là kỹ thuật có thể tạo ra nhiều chỉ thị di truyền nhất với số lƣợng mồi tối thiểu. Hệ thống này có độ phân giải rất cao, lƣợng băng thu đƣợc rõ nét. Vì vậy, nó đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các phịng thí nghiệm hiện nay [2]. Đây là một kỹ thuật thiết thực và đáng tin cậy bởi sự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng.
Đối với mỗi tổ hợp mồi, kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lƣợng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kỹ thuật khác. Lƣợng DNA tổng số tiêu tốn cho kỹ thuật này lại rất ít. Đây là phƣơng pháp có hiệu quả cao trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen. Tuy nhiên chỉ thị này là di
truyền trội, khơng có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp và thể dị hợp, khi sử dụng giá thành tƣơng đối cao.
- Chỉ thị STS (Sequence tagged sites)
Loại chỉ thị này lần đầu tiên đƣợc đề xuất bởi Olson năm 1989. Chỉ thị này đƣợc đƣa ra từ việc xác định trình tự hai đầu của mẫu dị RFLP, trên cơ sở đó ngƣời ta thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR. STS là các trình tự xác định, có vị trí duy nhất trên bản đồ, có thể sử dụng nhƣ các chỉ thị cho lập bản đồ những gen quan trọng trên NST. STS đƣợc ứng dụng nhƣ một chỉ thị DNA trong chọn giống vì đây là kỹ thuật thực hiện khá nhanh, thuận tiện, đặc hiệu cao, xác định trên NST và giá thành thấp trong phân tích di truyền.
Nhƣ vậy, về bản chất, chỉ thị STS là chỉ thị RFLP nhƣng lại đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật PCR thay cho kỹ thuật lai DNA [2]. Tuy nhiên, những ứng dụng của chị thị STS hiện nay vẫn cịn hạn chế vì số lƣợng chỉ thị STS đƣợc phát hiện cịn rất thấp và ít đa hình.
- Chỉ thị RAPD (Random amplified polymorphism DNA)
Đây là loại chỉ thị di truyền đƣợc tạo ra trên cơ sở của phản ứng PCR, sử dụng loại mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên dài 10 nucleotide ở nhiệt độ kết cặp thấp
(khoảng 370C) và quá trình nhân bội ngẫu nhiên những đoạn DNA hệ gen.
Sản phẩm nhân bội có thể đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát đƣợc sau khi gel đƣợc nhuộm với các hóa chất đặc trƣng.
Tuy nhiên, chỉ thị này là loại di truyền trội, không phân biệt đƣợc thể đồng hợp và thể dị hợp. Sự khác biệt giữa 2 cá thể có thể nhận biết bằng sự có mặt hoặc vắng mặt của các băng RAPD đặc trƣng. Đó là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội AFLP. Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại. Lợi thế của loại này là không cần biết những thơng tin về
trình tự. Chỉ thị RAPD cịn có thể sử dụng trong việc điền vào chỗ trống trên bản đồ phân tử RFLP, lập bản đồ gen kháng đạo ôn ở lúa…
Phƣơng pháp này đơn giản, rẻ tiền, dễ sử dụng. Tuy nhiên độ chính xác cịn phụ thuộc vào điều kiện phản ứng, thiết bị vận hành (máy PCR), và các kỹ năng thực hành của cá nhân cán bộ nghiên cứu.
- Chỉ thị SSRs (Simple sequence repeats hay Microsatellites)
Các chỉ thị phân tử DNA thƣờng đƣợc gọi tên theo kỹ thuật tƣơng ứng nhƣ: RAPD, AFLP, STS, SSR… Tùy thuộc vào từng nghiên cứu cụ thể, các nhà khoa học sẽ lựa chọn chỉ thị thích hợp để sử dụng
SSRs là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự (theo trật tự đầu cuối), gồm những đơn vị có chiều dài từ 1-6 nucleotide lặp lại (hay kiểu lặp lại ngắn) đƣợc gọi là Microsatellites. SSRs có trong khắp hệ gen của cơ thể Eukaryote khác nhƣ gia cầm, động vật có vú, cá và trên vài loại cây một lá mầm và hai lá mầm.
Bản chất đa hình của Microsatellites có thể đƣợc tạo ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ việc sử dụng hai đoạn mồi bổ sung với trình tự gần kề hai đầu đoạn lặp lại. Giá trị của SSR ở chỗ nó sinh ra đa hình từ nhiều vùng tƣơng ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội nên dễ dàng phát hiện bằng phản ứng PCR. Những đoạn đa hình đơn giản này đã đƣợc ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả động vật và thực vật.
Kỹ thuật SSR là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp đơn giản, còn gọi là phƣơng pháp vi vệ tính (Microsatellites). Các đoạn lặp lại gồm 2 đến 6 cặp nucleotide đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần trong hệ gen. Đoạn SSR điển hình là các đoạn có trình tự gồm 3 cặp nucleotide , lặp lại từ 9-30 lần. Các đoạn trình tự bảo thủ thƣờng dùng trong kỹ thuật SSR là ATT, AT, CTT, CT… Các đoạn lặp lại có kích thƣớc dài ngắn khác nhau tùy theo từng lồi, từng giống vật ni cây trồng [2].
SSR là kỹ thuật dựa trên chuỗi phản ứng PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này đƣợc nhận dạng, bƣớc tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế mồi. Các trình tự liền kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. Các mồi SSR sau đó sẽ đƣợc sử dụng nhƣ với mồi RAPD.
Nhƣ vậy có thể thấy chỉ thị SSR là một loại chỉ thị chính xác, hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một lồi. Do đó, SSR cung cấp cho nhà chọn giống công cụ hiệu quả để liên kết kiểu hình với sự đa dạng của kiểu gen, chọn lọc các tính trạng mong muốn. Ngồi ra, SSR cịn có thể phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ alen của cùng một locus.
Để xác định sự có mặt của gen Saltol trong quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1, BC3F2 chúng tôi lựa chọn sử dụng chỉ thị SSRs liên kết với QTL/Saltol .
1.3.3. Ứng dụng phương pháp MAS(Marker Assisted Selection) trong chọn tạo giống
Từ lâu các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nơng học quan trọng và sử dụng nó nhƣ một phƣơng tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Thay vì phải đánh giá kiểu hình của cả quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, ngƣời ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó.
Ngày nay phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là phƣơng tiện hữu ích trợ giúp cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống khó giải quyết. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, chỉ thị phân tử đã giải phóng cho các nhà chọn giống khỏi một lƣợng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lƣợng ít ỏi các cá thể quan tâm trong rất nhiều cá thể khác nhờ việc xác định sự có mặt hay vắng mặt của chỉ thị phân tử liên kết những alen đặc hiệu mà không cần đánh giá kiểu
hình. Phƣơng pháp này có thể giúp chọn lọc những cá thể mang nhiều tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tƣơng tác trong cùng alen hay giữa các alen khác nhau gây ra. Các tƣơng tác này thƣờng khơng thể phát hiện đƣợc bằng các phân tích kiểu hình.
Bảng 4 So sánh chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái
Nội dung Chỉ thị phân tử Chỉ thị hình thái
Kiểu gen của các locus
Có thể xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất kỳ mức độ nào: tế bào, mơ hay tồn cơ thể
Có thể phân biệt đƣợc trong những giai đoạn nhất định và thƣờng ở mức độ toàn bộ cơ thể
Số lƣợng chỉ thị Cực lớn Rất hạn chế
Các allen khác nhau
Không liên kết với các hiệu ứng có hại
Việc đánh giá thƣờng đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình khơng mong muốn
Các allen Phần lớn là đồng trội, nên
cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào
Tƣơng tác theo kiểu trội – lặn, nên bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai.
Hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp
Hiệu ứng lấn át làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly
Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử giúp các nhà chọn giống có thể:
- Tìm kiếm phát hiện những biến dị di truyền trong số các cá thể giữa các
- Chọn lọc chính xác các tổ hợp gen quan tâm ngay ở giai đoạn cây con, nên tiết kiệm đƣợc thời gian, nguồn lực, tiền bạc
- Cải tiến giống cây trồng nhanh, hiệu quả do không phụ thuộc vào giai đoạn sinh trƣởng, không bị ảnh hƣởng của môi trƣờng.
Chỉ thị phân tử làm tăng hiệu quả sàng lọc trong các chƣơng trình chọn giống nhờ các ƣu điểm sau:
- Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc và phát hiện khi chúng đƣợc biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phƣơng pháp chọn giống truyền thống (nhƣ chất lƣợng quả, hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng với chu kỳ quang…)
- Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó
khăn, đắt tiền và tốn thời gian (nhƣ hình thái rễ, tính kháng hay nhiễm đối với dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính chống chịu những điều kiện gây sốc sinh học nhƣ hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc…)
- Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp hay dị hợp của nhiều locus trong
cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau.
- Khả năng chọn lọc đồng thời nhiều đặc tính trong cùng một thời gian, do
đó có thể đƣa vào cùng lúc nhiều gen có giá trị về mặt nơng học (nhƣ đƣa cùng lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau).
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã đƣa ra và phân tích rất chi tiết một vài mơ hình MAS. Theo một số mơ hình thì chỉ cần tiến hành lai trở lại 4 thế hệ thay vì 6 thế hệ nhƣ trƣớc kia, ngay cả khi quần thể chọn giống có kích thƣớc nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế. Trong một số trƣờng hợp thuận lợi, các nhà chọn giống có thể chỉ cần 3 lần lai trở lại là có thể đạt đƣợc kết quả nhƣ ý.
Hƣớng nghiên cứu chọn giống nhờ chỉ thị phân tử có thể nói là hƣớng đi đầy triển vọng khi gắn kết đƣợc chọn giống truyền thống và công nghệ sinh học hiện
đại. Nhờ đó, q trình lập bản đồ di truyền, quá trình chọn lọc tính trạng đơn gen, đa gen có giá trị cao về mặt di truyền và kinh tế.
1.4. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong và ngồi nƣớc
1.4.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn ở nước ngoài
1.4.1.1. Nghiên cứu theo phƣơng pháp truyền thống
Trên Thế giới, việc chọn tạo giống lúa chịu mặn đáp ứng với biến đổi khí hậu đã đƣợc các nhà khoa học chú trọng nghiên cứu từ lâu.
Đánh giá khả năng chịu mặn ở lúa: kiểu gen chịu ảnh hƣởng của các chất
dinh dƣỡng (K+
, Ca2+ và Mg2+
) ở giai đoạn mạ do Zhang Zhen –hua và cộng sự, đăng trên tạp chí Khoa học nơng nghiệp Trung Quốc(2011).
Một số nghiên cứu trên các giống lúa khác nhau đã cho hệ số biến động di
truyền khác nhau. Các giống lúa chịu mặn duy trì nồng độ Na+ và Cl- thấp, nồng
độ K+
và Zn2+ cao hơn và tỷ lệ Na+/K+ thấp trong mầm lúa. Kết quả trên một số
giống lúa chịu mặn nhƣ Pokkli, SR26B IR28 và IR29 cho thấy, tỷ lệ Na+/K+ rất
thấp trong giống Pokkli (0,397) , SR26B (0,452) trong khi tỷ lệ này khá cao ở IR28 (0,652), IR29 (0,835) [19].
Tính chống chịu của lúa đƣợc điều khiển bởi đa gen [33]. Khi đánh giá tính chống chịu mặn ở giai đoạn mạ, trong dung dịch dinh dƣỡng Yoshida có độ mặn
EC = 12dSm-1, các yếu tố mơi trƣờng đƣợc kiểm sốt trong 19 ngày. Kết quả cho
thấy, lúa tăng khả năng hấp thu K+ là duy trì tốt tỷ lệ cân bằng Na+/K+ trong chồi. Tỷ lệ này đƣợc kiểm soát bởi hiệu quả của gen cộng sinh và gen trội.
Theo báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào soma lúa để tạo ra các biến dị soma chống chịu mặn cho thấy, từ giống Pokkali đã thu đƣợc dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 là giống lúa cao sản, thấp cây, sinh trƣởng mạnh, chống chịu mặn cao nhƣ Pokkali, gạo có màu trắng và phẩm chất gạo tốt hơn giống gốc, cho năng suất cao hơn Pokkali. Giống lúa này đƣợc sử dụng nhiều trong các chƣơng trình chọn tạo giống lúa mặn tại nhiều trung tâm nghiên cứu lúa trên thế
Với nhóm Japonica, có ít dịng giống thể hiện tính kháng mặn hơn nhóm Indica. Một số giống thuộc các nƣớc ơn đới có tính chịu mặn khá nhƣ Harra (Tây Ban Nha), Agami (Ai Cập) và Daeyabyeo (Hàn Quốc). Các giống Japonica nhiệt đới giống nhƣ Moroberekan mang tính kháng mặn cao, có nguồn gốc ở Guinea nơi đất canh tác ảnh hƣởng ngập mặn. Giống này đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng làm cây cho gen kháng mặn và lập bản đồ quần thể [44].
Cho đến thời điểm hiện tại đã có rất nhiều nghiên cứu đánh giá và xác định về tính chịu mặn của các giống lúa bản địa và giống lúa cải tiến. Các giống lúa địa phƣơng có nguồn gốc từ các vùng dun hải Đơng Á có tính kháng mặn cao nhƣ Nona Bokra (Ấn Độ), Pokkali (Sri Lanka), Getu (Ấn Độ), Khao Seetha (Thái Lan)… các giống thể hiện tính kháng mặn trên đều thuộc nhóm Indica. Theo số liệu cập nhật gần đây, một số dịng giống thuộc nhóm Indica có nguồn gốc từ Saudi Arabia, Hawashi thể hiện tính chịu mặn vƣợt trội cao hơn cả Pokkali và Nona Bokra [43].
1.4.1.2. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
Việc nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị phân tử trong di truyền chọn giống cây trồng đƣợc rất nhiều phịng thí nghiệm trên Thế giới thực hiện và đạt đƣợc những thành tựu đáng kể.
Các nhà khoa học tại trƣờng Đại học Cornel (Mỹ) đã định vị hàng loạt các chỉ thị phân tử RFLP trên bản đồ di truyền ở lúa.
Hiện nay có rất nhiều chỉ thị phân tử ở lúa đã đƣợc phát hiện và thiết kế, trong đó có nhiều chỉ thị liên kết với gen có ý nghĩa kinh tế quan trọng: khoảng 20 gen kháng bệnh bạc lá, 30 gen kháng bệnh đạo ôn, 12 gen kháng rầy nâu…
Phần lớn các nghiên cứu sử dụng các quần thể Indica lai với Japonica (nhƣ IR64 x Azucena hoặc Co29 x Moroberekan), và lập bản đồ quần thể RIL, DH