Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.5.1. Phƣơng pháp tách CTAB
- Phƣơng pháp tách CTAB cải tiến dựa trên phƣơng pháp của Shagai Maroof
o Lá của các dòng, giống lúa nghiên cứu đƣợc cắt và lấy mẫu vào các ống eppendorf 1,5ml để trong đá lạnh (mục đích giữ lá đƣợc tƣơi). Thời gian thu mẫu tốt nhất: vào sáng sớm khi nồng độ muối trong lá thấp, các enzyme hoạt động ít
o Nghiền mẫu với nitơ lỏng trong eppendorf hoặc cối, đến khi thành bột mịn
(chú ý khi nghiền luôn để mẫu ở trong nitơ lỏng)
o Cho mẫu đã nghiền mịn vào ống eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết EB (extraction buffer) rồi đảo đều, giữ trong đá. Thêm 50µl SDS 10%
o Đặt vào thiết bị ủ trong 30phút ở 650C, thỉnh thoảng đảo cho dung dịch đƣợc
trộn đều
o Ly tâm ở 13500 rpm trong 20phút
o Lấy ra, chiết dịch nổi ở phía trên sang 1 eppendorf mới. Thêm 1ml Isopropanol alcohol rồi để vào tủ 40C cho kết tủa khoảng 30phút
o Ly tâm ở 13500 rpm trong 25 phút
o Đổ hết dịch nổi ở phía trên rồi giữ lại phần tủa ở dƣới đáy eppendorf. Cho
400µl đệm TE (tỷ lệ 10:0,1) cho vào tủ ấm 650
C ủ trong 5phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hịa tan tủa, có thể giữ ở 40C qua đêm.
o Cho 3 µl Rnase (10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ trong 370
C trong 3 tiếng.
o Thêm 400 µl đệm CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút, thỉnh thoảng
trộn, lắc đều
o Cho vào tủ hút thêm 800 µl Chloroform/Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), lắc, trộn từ 5-7 phút nhằm loại bỏ protein.
o Ly tâm ở 13500 rpm trong 10phút. Dung dịch bên trong eppendorf chia làm
2 phần.
o Dùng pipet, hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang một enppendorf mới. Nếu
chƣa sạch có thể chiết lại lần 2 với Chloroform/Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1),
o Thêm 2,5 lần thể tích Ethanol 96% và cất giữ ở tủ lạnh sâu (-200 C)
o Ly tâm ở 13500 rpm trong 30phút. Loại bỏ cồn để giữ lại phần tủa trắng ở
o Rửa tiếp bằng 400cồn 70% rồi đƣa vào máy ly tâm. Ly tâm ở 13500 rpm trong 5phút
o Đổ cồn đi giữ lại tủa, cho vào máy làm khô chân không khoảng 10phút làm
khơ tủa DNA, sau đó cho vào 100µl TE (tỷ lệ 10:0,1) vào mỗi eppendorf để hòa tan tủa.
o Giữ DNA ở tủ lạnh sâu (-200C) để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.