Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.5.2. Kỹ thuật PCR với các mồi SSR
- Các chu trình của phản ứng PCR với các mồi SSR, qua các bƣớc:
o Bƣớc biến tính: ở chu kỳ đầu tiên biến tính mẫu DNA ở nhiệt độ 940
C trong 5phút, 30 giây
o Bƣớc gắn mồi: thực hiện ở 550
C trong 30 giây
o Bƣớc tổng hợp thực hiện ở nhiệt độ 720C trong 30 giây
- Thành phần phản ứng Thành phần Thể tích (µl) H2O (nƣớc cất 2 lần) 5,5 Buffer 1 dNTPs 1 MgCl2 0,53 Primer 1 Taq Polymerase 0,1 DNA 1,2 Tổng số 10,26
- Thực hiện các bƣớc trên với 35 chu kỳ, sau đó ở chu kỳ cuối cùng chạy thêm 720C trong 7 phút sau đó bảo quản ở nhiệt độ 40
C
- Sau khi chạy PCR xong, cất giữ mẫu ở nhiệt độ 40C. Trƣớc khi đem phân tích
phải đƣợc nhỏ thuốc nhuộm Ethidium Bromide vào các mẫu, sau đó đƣa vào
máy PCR gây biến tính ở 940C trong 5phút sau đó để mẫu vào ln khay đựng
đá lạnh rồi tiến hành tra mẫu DNA vào bản gel điện di. 2.3.5.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%
- Ngun tắc : DNA tích điện âm khơng đổi nhờ khung phosphate vì thế khi đặt
trong điện trƣờng, các phân tử DNA dịch chuyển từ cực âm sang cực dƣơng và các phân tử DNA có khối lƣợng và điện tích khác nhau sẽ đƣợc phân tách.
- Mục đích : Nhằm phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau, xác định
đƣợc sự có mặt các đoạn DNA quan tâm
1. Chuẩn bị bản gel
- Cân 0,8g agarose cho vào 100 ml đệm TBE ở nhiệt độ phòng, khuấy đều trên
máy khuấy từ, để yên 1 phút, cho vào lị vi sóng – mục đích làm nóng chảy gel và khơng tạo bọt.
- Làm nguội gel đến 50-55oC, thêm 1µl Ethidium Bromide vào.
- Đổ gel vào khuôn gel và lắp lƣợc
- Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lƣợc và đổ đệm chạy vào
khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 3-5mm
2. Kỹ thuật điện di trên gel agarose
- Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lƣợc và đổ đệm chạy vào
khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 3-5mm
- Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng tƣơng ứng theo thứ tự mẫu
- Đậy nắp, cắm điện cực
- Điện di trong 30 phút với điện thế 100-120V
2.3.5.4. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 4,5%
1. Chuẩn bị bản gel
- Ngâm kính trong dung dịch NaOH (120g + 2000ml H2O) hòa tan
- Rửa kính thật sạch bằng khăn miết sạch với xà phịng pha lỗng rồi tráng qua nƣớc cất
- Tấm kính nhỏ (tấm kính có mặt khơng bám):
o Lau nhẹ bằng nƣớc cất, để khô
o Lau tiếp bằng cồn 96%
o Nhỏ 300 µl Rain-X (Sigma cord), xoa nhanh tay, nhẹ và đều
- Tấm kính lớn (tấm kính bám gel)
o Lau 3 lần với nƣớc cất, để khô
o Lau tiếp 3 lần với cồn 96%
o Nhỏ 300 µl Binding Solution đã pha trong eppendorf vào tấm kính (1ml cồn 96% + 5µl acid acetic 5% + 3µl Binding), xoa đều, nhanh khắp bề mặt của kính, để khơ khoảng 5 phút
- Đặt hai thanh nhựa lót vào 2 bên của tấm kính nhỏ, úp hai tấm kính vào nhau.
- Pha dung dịch đổ gel (các hóa chất dùng để pha acrylamide đều phải để lạnh)
gồm có:
o Dung dịch Acryamide (thành phần xem trong phụ lục 1)
o Dung dịch đổ gel (thành phần xem trong phụ lục 1)
- Cho dung dịch đổ gel này vào cốc, lắc đều, sau đó đổ nhanh tay vào khe của 2
tấm kính đã ghép, cài lƣợc vào, dùng kẹp giữ lƣợc và mặt gel, lƣợc sẽ tạo thành các giếng để load
- Ở mặt đặt lƣợc, đặt thêm giấy thấm nƣớc cất cho gel không bị khơ
- Dùng giấy bóng quấn quanh đầu gel đến khi kết thúc (1-2h)
- Đánh dấu mặt gel khi rút lƣợc ra, dựng gel đứng, chạy gel trong dung dịch TBE
1X với 2000ml ở 30 phút cho nhiệt độ tăng lên 500C thì cài lƣợc vào nhƣ cũ, rồi load mẫu
- Khi load mẫu thì load theo thứ tự đã đánh dấu
- Chạy gel trong 2h ở điện thế 50-60mA và 300W
2. Kỹ thuật nhuộm bản gel (nhuộm bạc)
- Rút hết đồ cắm điện, đổ hết TBE 1X ra
- Tách rời 2 tấm kính
- Cho tấm kính lớn vào khay đã lau sạch
- Chuẩn bị các dung dịch nhuộm (xem trong phụ lục 1):
o Dung dịch cố định, dừng phản ứng (Fix Solution)
o Dung dịch nhuộm (Staining Solution)
o Dung dịch hiện (Developing Solution)
- Tiến hành nhuộm:
o Sau khi tiến hành chạy điện di xong, tháo lấy tấm kính lớn có bám gel để
tiến hành nhuộm
o Cố định gel:
Đổ dung dịch Fix Solution (cố định, dừng phản ứng) vào khay có chứa tấm kính lớn, sao cho mặt bám gel hƣớng lên trên, lắc nhẹ trong 30phút
Rửa tấm kính bằng nƣớc cất 3 lần, mỗi lần 2 phút (V=2000ml H2O)
o Nhuộm Staining Solution
Đổ dung dịch Staining Solution vào khay có chứa tấm kính lớn, sao
cho mặt bám gel hƣớng lên trên, lắc nhẹ trong 30phút
Rửa tấm kính bằng nƣớc cất 2 lần (V=2000ml H2O), mỗi lần không
quá 10 giây
o Nhuộm Developing Solution
Đổ dung dịch Developing Solution (có váng đá trên bề mặt dung dịch
là tốt nhất) vào khay có chứa tấm kính lớn, sao cho mặt bám gel hƣớng lên trên, lắc nhiều lần để hiện băng DNA
Khi bang DNA đƣợc hiện rõ, đem ngâm tấm kính vào dung dịch Fix Solution trong 1 phút
Rửa lại bằng nƣớc cất cho hết mùi và dung dịch bám trên gel
Đặt tấm kính lên tấm giấy thấm ở dƣới cho khơ
Score xác định băng gel
Đƣa tấm kính vào tủ sấy khơ và sau đó là scan trên máy tính
2.3.5.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Thí nghiệm đồng ruộng đƣợc xử lý dữ liệu qua chƣơng trình Irristat 5.0, Excel
2010
- Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu bằng phƣơng pháp của IRRI
và phƣơng pháp thanh lọc mặn của Yoshida và cs (1976).
- Phân tích đánh giá đa hình DNA của các dịng giống bố mẹ của các tổ hợp lai
triển vọng theo các chỉ thị đã lựa chọn qua thông tin đã công bố và các thông tin tự lựa chọn, thiết kế trên cơ sở bản đồ phân tử đã đƣợc công bố về các gen quan tâm. Chọn ra các chỉ thị cho đa hình giữa các dịng giống bố mẹ của tổ hợp lai.
- Số liệu đƣợc ghi nhận trong Excel 2010 và xử lý thông qua phần mềm chuyên
dụng Graphical Genotyper (Van Berloo, 2008) trong phân tích di truyền: dữ liệu của từng chỉ thị SSR đối với các alen đồng hợp tử giống nhận gen là “A”, đồng hợp tử giống cho gen là “B” và dị hợp tử là “H”, số % alen của cây nhận gen là “R”.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ
3.1. Kết quả đánh giá xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu
3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa trong điều kiện nhân tạo nhân tạo
Kết quả thanh lọc mặn của các giống lúa nghiên cứu có bổ sung NaCl 6‰ vào dung dịch Yoshida đƣợc thể hiện qua bảng 7:
Bảng 7: Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các giống
TT Tên giống
Cấp hại sau 2 tuần xử lý NaCl 6‰
Lặp 1 Lặp 2 Lặp 3 Trung bình
1 Pokkali (chống chịu) 1 1 3 1.7
2 IR29 (mẫn cảm 7 7 9 7.7
3 FL478 1 3 1 1.7
4 OM6976 5 7 7 6.3
Theo đánh giá tính chịu mặn của các giống lúa của IRRI, 1997 khi giống lúa IR29 có biểu hiện tổn thƣơng, tăng trƣởng bị ngƣng lại hoàn toàn, hầu hết các lá bị khô, một vài chồi bị chết (điểm 7) hoặc tất cả các cây đều bị chết khơ (điểm 9) thì tiến hành quan sát, đánh giá theo tiêu chuẩn SES.
Sau 2 tuần xử lý mặn ở nồng độ NaCl 6‰ giống IR29 sinh trƣởng bị ngƣng lại hoàn toàn, hầu hết các lá bị khơ (điểm 7) trong khi đó giống Pokkali vẫn sinh trƣởng bình thƣờng, chỉ xuất hiện một vài lá có vết trắng, lá hơi cuốn lại (điểm 1-3) tƣơng đƣơng với giống FL478 (điểm 1-3). Trong khi đó, giống OM6976 khơng có khả năng chịu mặn nên sau 2 tuần, hầu hết các cây trong thí nghiệm đều bị khơ lá.
3.1.2. Kết quả đánh giá xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu
Từ việc đánh giá các đặc tính nơng sinh học của vật liệu khởi đầu cũng nhƣ khả năng chống chịu của các giống lúa trong điều kiện mặn nhân tạo, chúng tôi đã rút ra
Bảng 8: So sánh hai giống FL478 và OM6976
Chỉ tiêu Giống FL478 Giống OM6976
Nguồn gốc
Viện lúa Quốc tế IRRI Lai tạo từ tổ hợp lai IR68144/OM997 (đƣợc
Cục Trồng trọt cơng nhận đặc cách chính thức giống lúa thuần tại các tỉnh vùng ĐBSCL, theo quyết định số 711/QĐ-TT-CLT ngày 7 tháng 12 năm 2011)
TGST 130 - 140 ngày (xuân
muộn) và 105 – 110 ngày (mùa sớm)
95-97 ngày đối với lúa sạ và 100-105 ngày
Cao cây 95 – 104 cm 100-110 cm
Năng suất Trung bình Tiềm năng năng suất cao, có thể đạt 7- 9
tấn/ha (vụ Đông Xuân), đạt 5 – 6 tấn/ha (vụ Hè thu)
Từ bảng thông tin trên cho thấy giống FL478 có thời gian sinh trƣởng dài hơn OM6976, do đó, để hai giống cùng trỗ trong khoảng thời gian nhất định, tạo điều kiện thuận lợi cho việc lai tạo giữa giống nhận và cho gen, đã tiến hành gieo FL478 trƣớc OM6976 từ 15 -20 ngày.
Bên cạnh đó, từ việc đánh giá khả năng chống chịu mặn ở nồng độ muối NaCl 6‰ giữa các giống OM6976, FL478, IR29, Pokkali, đã thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau:
Các giống đều ngừng sinh trƣởng, hầu hết lá bị khô, và một vài chồi bị chết, đặc biệt là giống IR29, một giống chuẩn nhiễm, đƣợc nhập từ IRRI, bị chết hoàn toàn sau 2 tuần xử lý mặn. Tuy nhiên, giống lúa OM6976 trong cùng điều kiện đánh giá cũng bị ngƣng sinh trƣởng, các lá bị khơ, thậm chí là vài chồi bị chết, do đó, chúng tơi nhận thấy giống OM6976 khơng có khả năng chống chịu mặn trong thí nghiệm.
Trong khi đó, giống FL478 có khả năng chịu mặn điểm 3 tƣơng đƣơng với giống chuẩn Pokali có khả năng chịu mặn tốt nhất, đây là giống hiện đang đƣợc trồng khá phổ biến tại một số nƣớc Nam và Đơng Nam châu Á, trong đó có Việt Nam.
Nhƣ vậy, từ việc thu thập và đánh giá các đặc điểm nông sinh học, tiềm năng năng suất cũng nhƣ tính chống chịu mặn của các giống lúa, đã xác định đƣợc vật liệu sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn là giống FL478 làm nguồn cho QTL/Saltol và giống OM6976 làm nguồn nhận QTL/Saltol.
3.2. Kết quả chọn tạo dòng lúa chịu mặn từ tổ hợp lai OM6976/FL478
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB
Tách chiết DNA từ mẫu lúa là bƣớc quan trọng để thu nhận DNA đủ độ tinh sạch cho các nghiên cứu tiếp theo. Trong nghiên cứu này, đã sử dụng phƣơng pháp CTAB có cải tiến để tách chiết DNA từ lá của các dòng bố mẹ cũng nhƣ các cá thể trong thí nghiệm nhằm tối ƣu hóa lƣợng DNA chiết tách và giảm sự đứt gãy của DNA trong quá trình thực hiện.
Lá non 3 tuần sau khi cấy của các giống lúa nghiên cứu đƣợc thu nhận và tách chiết DNA. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA đƣợc kiểm tra bằng gel agarose 0,8% cùng với λ DNA chuẩn. Nhuộm gel bằng Ethidium bromide và ghi nhận kết quả trên máy UV
Hình 7. Kết quả kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%
Ghi chú: giếng số 1: giống lúa FL478, giếng số 2: λ DNA chuẩn, giếng số 3: giống lúa OM6976, các giếng số 4- 11: các cá thể của quần thể BC1F1
Dựa vào độ sáng và gọn của các băng DNA cho thấy phƣơng pháp tách chiết bằng CTAB cho hiệu quả cao, DNA thu đƣợc nguyên vẹn, không lẫn tạp chất, các băng hiển thị rõ và có nồng độ cao trong khoảng từ 200ng/µl. Từ kết quả thu nhận đƣợc chứng tỏ DNA đảm bảo đủ độ tinh sạch, đạt yêu cầu để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Kết quả kiểm tra đa hình tại locus gen saltol giữa FL478 và OM6976.
Kế thừa từ các kết quả, vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu các chỉ thị phân tử có liên quan trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa chịu mặn từ dự án “Tạo giống
lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho các vùng bờ biển đồng bằng Việt Nam” do chính phủ Đan Mạch tài trợ giai đoạn 2010-
2012, đã xác định đƣợc có 6 chỉ thị phân tử nằm trong khu vực QTL/Saltol từ AP3206 (tại vị trí 11,2Mb) đến RM10825 (tại vị trí 13,3Mb). Các chỉ thị này đƣợc sử dụng trong việc sàng lọc các cá thể mang gen đích trong quần thể FL478 và OM6976. Vị trí của các chỉ thị phân tử đa hình tại QTL/Saltol từ 11,2 Mb -13,3 Mb, cụ thể: AP3206 (11,2 Mb); RM3412b(11,6 Mb); RM10748(11,8 Mb); RM493 (12,3 Mb); RM140(12,3 Mb) và RM10825 (13,3 Mb).
Trong khuôn khổ của luận văn này, chúng tôi sử dụng 2 chỉ thị RM3412b và RM493 là hai chỉ thị cho đa hình rõ nhất với giống OM6976 để sàng lọc các cá thể mang QTL/Saltol trong quần thể lai tạo.
3.2.3 Kết quả lai tạo con lai F1 của tổ hợp lai OM6976 và FL478
Để chọn lọc các cá thể mang kiểu locus gen Saltol chịu mặn, tiến hành lai
tạo tạo con lai F1 giữa OM6976 và FL478, kết quả thu đƣợc 20 hạt lai. Hạt lai F1
đƣợc gieo trồng trong điều kiện nhà lƣới thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp.
Khi lúa đƣợc 2 tuần tuổi, tiến hành thu nhận mẫu lá để phân tích DNA. Việc xác định chính xác con lai F1 là cần thiết để phát triển tạo quần thể BC1F1.Thí nghiệm này sử dụng chỉ thị đa hình RM3412b, RM493 giữa OM6976 và FL478 trên NST số 1 để kiểm tra các cá thể lai.
Kết quả thu đƣợc 16/20 cá thể F1 cho dị hợp tử tại các vị trí chỉ thị phân tử. Sau khi chọn đƣợc 16 cá thể lai mang kiểu gen dị hợp tử, tiến hành lai ngƣợc trở lại với OM6976 để thu nhận các cá thể của quần thể BC1F1.
3.2.4. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC1F1 thể BC1F1
Để xác định các cá thể có mang QTL/Saltol trong các thế hệ lai trở lại hay không, tiến hành kiểm tra bằng hai chỉ thị phân tử là RM493 và RM3412b
Ở thế hệ BC1F1, đã sử dụng 20 cá thế BC1F1 từ hạt lai F1 giữa OM6976 và FL478. Khi lúa đƣợc 2 tuần tuổi, tiến hành thu nhận mẫu lá của 20 cá thể thuộc quần thể
BC1F1 để phân tích DNA, kiểm tra sự có mặt của QTL/Saltol, mỗi cá thể đƣợc đeo
thẻ theo số thứ tự các dòng và thứ tự cây thu mẫu. Hai chỉ thị phân tử RM493 và RM3412b đƣợc sử dụng để xác định các cá thể mang gen QTL/Saltol trong quần thể BC1F1.
Kết quả xác định cá thể BC1F1mang QTL/Saltol bằng chỉ thị phân tử RM493 đƣợc
thể hiện trên kết quả băng điện di hình 8.
Hình 8: Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên20 cá thể BC1F1
P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-20: các cá thể BC1F1
Qua phân tích trên hình 8, đã chọn ra đƣợc các cá thể đƣợc đánh số lần lƣợt là 1, 3, 5, 6, 11, 14, 15, 17, 18, 19 là các cá thể mang QTL/Saltol (ký hiệu là H) và có băng DNA trên gel giống với FL478.
Tƣơng tự, khi chạy điện di với chỉ thị RM3412b trên 20 cá thế BC1F1, chúng tôi cũng thu nhận đƣợc băng điện di nhƣ sau:
Hình 9: Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên20 cá thể BC1F1
P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-20: các cá thể BC1F1
Trong 20 cá thể nghiên cứu, đã chọn ra đƣợc các cá thể mang số 1, 6, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 19 là các cá thể mang QTL/Saltol nhờ vào sự hiển thị băng DNA giống với dịng bố mang gen Saltol (hình 9).
Kết hợp hai chỉ thị RM493 và RM3412b đã sàng lọc đƣợc 6 cá thể mang QTL/Saltol có số thứ tự là 1, 6, 14, 15, 17, 19 cá thể này sẽ đƣợc chọn lọc để tiến hành lai tạo quần thể BC2F1.
3.2.5. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC2F1