Chƣơng 3 : KẾT QUẢ
3.2. Kết quả chọn tạo dòng lúa chịu mặn từ tổ hợp lai OM6976/FL478
3.2.4. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong
3.2.4. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC1F1 thể BC1F1
Để xác định các cá thể có mang QTL/Saltol trong các thế hệ lai trở lại hay không, tiến hành kiểm tra bằng hai chỉ thị phân tử là RM493 và RM3412b
Ở thế hệ BC1F1, đã sử dụng 20 cá thế BC1F1 từ hạt lai F1 giữa OM6976 và FL478. Khi lúa đƣợc 2 tuần tuổi, tiến hành thu nhận mẫu lá của 20 cá thể thuộc quần thể
BC1F1 để phân tích DNA, kiểm tra sự có mặt của QTL/Saltol, mỗi cá thể đƣợc đeo
thẻ theo số thứ tự các dòng và thứ tự cây thu mẫu. Hai chỉ thị phân tử RM493 và RM3412b đƣợc sử dụng để xác định các cá thể mang gen QTL/Saltol trong quần thể BC1F1.
Kết quả xác định cá thể BC1F1mang QTL/Saltol bằng chỉ thị phân tử RM493 đƣợc
thể hiện trên kết quả băng điện di hình 8.
Hình 8: Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên20 cá thể BC1F1
P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-20: các cá thể BC1F1
Qua phân tích trên hình 8, đã chọn ra đƣợc các cá thể đƣợc đánh số lần lƣợt là 1, 3, 5, 6, 11, 14, 15, 17, 18, 19 là các cá thể mang QTL/Saltol (ký hiệu là H) và có băng DNA trên gel giống với FL478.
Tƣơng tự, khi chạy điện di với chỉ thị RM3412b trên 20 cá thế BC1F1, chúng tôi cũng thu nhận đƣợc băng điện di nhƣ sau:
Hình 9: Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên20 cá thể BC1F1
P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-20: các cá thể BC1F1
Trong 20 cá thể nghiên cứu, đã chọn ra đƣợc các cá thể mang số 1, 6, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 19 là các cá thể mang QTL/Saltol nhờ vào sự hiển thị băng DNA giống với dịng bố mang gen Saltol (hình 9).
Kết hợp hai chỉ thị RM493 và RM3412b đã sàng lọc đƣợc 6 cá thể mang QTL/Saltol có số thứ tự là 1, 6, 14, 15, 17, 19 cá thể này sẽ đƣợc chọn lọc để tiến hành lai tạo quần thể BC2F1.
3.2.5. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC2F1 thể BC2F1
Sau khi thu đƣợc 6 cá thể dị hợp tử mang QTL/Saltol ở thế hệ BC1F1, tiến hành lai trở lại với OM6976 để thu nhận các cá thể của quần thể BC2F1. Ở thế hệ BC2F1, đã tiến hành chạy điện di trên 18 cá thể để xác định cá thể mang gen dị hợp tử . Kết quả chạy điện di với hai chỉ thị RM493 và RM3412b nhƣ sau:
Hình 10: Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 18 cá thể BC2F1
P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-18: các cá thể BC2F1
Từ kết quả chạy điện di với chỉ thị RM493 trên hình 10, đã xác định đƣợc 9 cá thể mang gen dị hợp tử đƣợc mang số theo thứ tự là: 3, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17
Hình 11: Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 18 cá thể BC2F1
P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-18: các cá thể BC2F1
Trong 18 cá thể nghiên cứu, đã chọn ra đƣợc các cá thể mang số 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 14, 15 là các cá thể mang gen dị hợp tử (hình 11). Đây là các cá thể mang QTL/Saltol nhờ vào sự hiển thị băng DNA giống với dòng bố mang gen Saltol. Các cá thể còn lại chỉ mang băng giống với giống nhận gen OM6976 nên không đƣợc lựa chọn do không mang QTL/Saltol.
Kết hợp hai chỉ thị RM493 và RM3412b đã sàng lọc đƣợc 5 cá thể mang QTL/Saltol có số thứ tự là 3, 7, 10, 11, 15. Số cá thể mang gen dị hợp tử này sẽ đƣợc chọn lọc để tiến hành lai tạo quần thể BC3F1.
3.2.6. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC3F1 thể BC3F1
Số cá thể mang gen dị hợp tử đƣợc chọn lọc từ BC2F1, đƣợc lai ngƣợc với
OM6976 để thu nhận quần thể BC3F1. Sau đó chúng tơi cũng tiến hành gieo trồng,
khi lúa đƣợc 14 ngày, tiến hành thu nhận mẫu lá để xác định các cá thể mang gen dị hợp tử nhờ vào việc sử dụng các chỉ thị phân tử. Kết quả sau khi chạy điện di trên gel polyacrylamide đƣợc thể hiện trên hình 12:
Từ hình 12, chúng tơi đã xác định đƣợc các cá thể mang số 1, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 16, 17, 21, 22 là các cá thể mang gen dị hợp tử. Các cá thể này có băng DNA hiển thị trên bản điện di giống với của giống bố. Các cá thể khác có băng DNA hiển thị giống mẹ, khơng có locus gen Saltol nên khơng đƣợc lựa chọn.
Tiếp tục sử dụng chỉ thị RM3412b để sàng lọc cá thể mang gen dị hợp tử, chúng tôi thu đƣợc kết quả sau:
Hình 13: Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 22 cá thể BC3F1
P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-22: các cá thể BC3F1
Các cá thể mang số: 2, 5, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 20, 22 là các cá thể đƣợc phát hiện là dị hợp tử nhờ vào băng DNA hiển thị trên bản gel giống với dịng bố (hình 13). Các cá thể còn lại không đƣợc chọn lọc do không chứa QTL/Salol và mang nền di truyền của dòng mẹ.
Kết hợp hai chỉ thị RM493 và RM3412b để sàng lọc, chúng tôi thu đƣợc 6 cá thể mang gen dị hợp tử lần lƣợt mang số 5, 8, 9, 12, 16, 22. Các cá thể này đƣợc chọn lọc và lai tạo quần thể BC3F2
3.2.7. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC3F2
Từ 6 cá thể thu nhận đƣợc ở quần thể BC3F1, tiến hành tự thụ để tạo quần thể BC3F2. Các cá thể đƣợc gieo trồng và thu nhận mẫu lá để kiểm tra trên gel polyacrylamide nhằm xác định các cá thể mang gen đồng hợp tử nhờ vào việc sử dụng 2 chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Saltol là RM493 vả RM3412b. Kết quả sau khi chạy điện di trên gel polyacrylamide đƣợc thể hiện trên hình 14:
Hình 14: Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 32 cá thể BC3F2
P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, B: FL478, từ 1-32: các cá thể BC3F2
Qua kết quả chạy điện di với 32 cá thể của quần thể BC3F2, chúng tôi đã xác định đƣợc 8 cá thể mang số 4. 7, 10, 11, 15, 16, 18, 26 là các cá thể đồng hợp tử theo FL478 (hình 14). Các cá thể này có băng DNA hiển thị trên bản điện di giống với của giống bố. Các cá thể đồng hợp tử với OM6976 (8 cá thể, với số thứ tự là 14, 19, 22, 23, 24, 29, 30, 32) và dị hợp tử (16 cá thể với số thứ tự tƣơng ứng là 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 17, 20, 21, 25, 27, 28 và 31) không đƣợc chọn lọc.
Tiếp tục sử dụng với chỉ thị RM3412b để sàng lọc cá thể mang gen đồng hợp tử, chúng tơi thu đƣợc kết quả sau:
Hình 15: Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 32 cá thể BC3F2
P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, B: FL478, H: dị hợp tử, từ 1-32: các cá thể BC3F2
Sau khi chạy điện di đã xác định đƣợc 8 cá thể đồng hợp tử với dòng mẹ, 8 cá thể đồng hợp tử với dòng bố và 16 cá thể dị hợp tử. Các cá thể đồng hợp tử theo dòng bố mang số: 1, 9, 10, 13, 17, 19 23, 26 đƣợc chọn lọc. Các cá thể dị hợp tử có số thứ tự tƣơng ứng là: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 11, 14, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 29 31 và các cá thể đồng hợp tử với dịng mẹ các cá thể này có số thứ tự lần lƣợt là: 7, 12, 15, 16, 27, 28, 30 và 32 khơng đƣợc chọn lọc (hình 15),
Kết hợp hai chỉ thị RM493 và RM3412b để sàng lọc, chúng tôi thu đƣợc 2 cá thể mang gen đồng hợp tử theo dòng bố mang số 10 và 26. Các cá thể này sẽ đƣợc cho tự thụ và dùng để nghiên cứu khả năng chịu mặn nhân tạo cũng nhƣ đánh giá ngoài đồng ruộng.