Chương 1 : TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
- DNA mẫu làm khuôn
Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1÷1,5kb.
Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt, tuy nhiên, kỹ thuật chuẩn đoán bằng phương pháp này vẫn đạt kết quả tốt trong trường hợp mẫu DNA không cần có độ tinh sạch cao, như vết máu khô, những mẫu vật khảo cổ (tóc, móng tay người đã chết). Phương pháp này cho phép xác định DNA với một lượng thấp, khoảng nhỏ hơn 100 ng (1g = 109ng).
- Enzyme DNA-polymerase
Chất lượng của phương pháp phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzyme polymerase (do phản ứng luôn phải thực hiện ở nhiệt độ khác nhau). Đầu tiên người ta sử dụng các đoạn Klenow của DNA-polymerase I từ E. Coli ở 37°C (cắt nhỏ mảnh DNA-polymerase I thành đoạn Klenow mất hoạt tính exonuclease) do đó đã nhận được đoạn cần nhân khơng tinh sạch vì đây khơng phải là enzyme chịu nhiệt. Phương pháp PCR chuyển sang một bước ngoặt mới cùng với sự phát hiện enzyme Taq- polymerase có nguồn gốc vi khuẩn (Thermus aquaticus) tách từ suối nước nóng nên chịu
được nhiệt độ cao. Với enzyme này cho phép nhận được các sản phẩm DNA tinh sạch. Điều này cho phép tự động hóa tất cả các bước của chu trình nhân bản DNA. Từ đó máy chu trình nhiệt PCR ra đời và có khả năng điều khiển về cả nhiệt độ lẫn thời gian. Ngày nay có rất nhiều hãng trên thế giới sản xuất máy chu trình nhiệt PCR như: Perkin Elmer, MJ, Eppendorf, ...
Nhược điểm của enzyme này là khơng tổng hợp được trình tự DNA dài quá 3kb, hơn nữa, enzyme này khơng có khả năng sửa sai trong q trình sao chép. Hiện nay có nhiều enzyme polymerase chịu nhiệt mới được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt và hoàn thiện hơn, như là Tth- polymerase tách từ vi khuẩn Themus thermophilus, Elogase (bao gồm nhiều enzyme kết hợp trong đó có sự tham gia của Taq- polymerese).
- Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi
Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Chọn mồi phải tuân theo nguyên tắc sau đây:
- Trình tự của mồi được chọn khơng có sự bắt cặp giữa mồi xi và mồi ngược, và cũng khơng tạo những cấu trúc kẹp tóc.
- Mồi phải chọn đặc trưng cho DNA cần khuếch đại và khơng trùng với các trình tự lặp lại trên gen.
- Trình tự nằm giữa mồi xi và mồi ngược không quá lớn (1kb).
- Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 đến 30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu. Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng ở Bước 3.
- Tm mồi xuôi và mồi ngược không cách nhau q xa, thơng thưịng trong khoảng từ 4÷5°C, và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 72°C.
- Ảnh hưởng của các nuleotit
Cần phải có bốn loại nucleotide dạng triphosphat như: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ mỗi loại nucleotide phải ở dạng cân bằng, ứng với khoảng 20ữ200àM cho mi loi nucleotide. Nếu mất trạng thái cân bằng thì sẽ gây ra lỗi khi sao chép, nếu nồng độ các nucleotide cao hay thấp hơn sẽ dẫn đến hiện tượng sao chép giả.
Ion Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ Mg2+ ti u thc hin PCR t 150ữ200àM. Nng độ chuẩn cho từng khoản tương ứng, phải được xác định trong điều kiện thí nghiệm nhất định.
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào. Không được chứa các enzyme cắt hạn chế và các enzyme phân hủy axit nucleic.
Môi trường dung dịch đệm phải ổn định.
- Thời gian và số lượng chu kỳ
Qua nghiên cứu cho thấy: tổng thời gian cho mỗi bước của một chu kỳ và của chu kỳ đầu với các chu kỳ tiếp theo là khác nhau. Ngoài ra, thời gian cho mỗi phản ứng còn phụ thuộc vào độ dài của đoạn DNA cần nhân dòng.
Số lượng chu kỳ cho một phản ứng PCR thông thường trong khoảng từ 30 đến 40 chu kỳ. Bởi vì phản ứng diễn biến theo hai giai đoạn: Ở giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân và đến một giới hạn nào đó thì số bản sao giảm, hiệu quả khuếch đại giảm do các nguyên nhân
+ Nồng độ nucleotide giảm, + Xuất hiện sản phẩm phụ,
+ Do các bản sao không bắt cặp với mồi mà chúng lại bắt cặp với nhau.
Ngoài ra, số chu kỳ phụ thuộc vào số bản mẫu ban đầu, nếu số bản mẫu là 105 thì thực hiện 25÷30 chu kỳ, cịn số mẫu 102÷103 thì thực hiện 35÷40 chu kỳ.
- Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt độ nhanh và chính xác. Tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng. Tuy nhiên, ứng với mỗi phản ứng cụ thể có các thiết bị và dụng cụ khuếch đại riêng.